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| Malus domestica. Frutos, hojas y flores |
“An apple at day keep the doctor away”. Refrán popular de Inglaterra.
“Eventually, the use of phlorizin may provide the molecular basis for the clinical observation that ‘an apple a day keeps the doctor away”. Joel R. L. Ehrenkranz et al.. En “Phlorizin: a review”. Diabetes Metab Res Rev 2005; 21:31-38.
“Eat an apple on going to bed, and you’ll keep the doctor from earning his bread.”. Refrán popular de Inglaterra.
“No hay otro fruto tan conocido en Inglaterra como la manzana… Estoy convencido de que los ingleses no podemos vivir sin ella, ya sea transformada en la excelente bebida que conocemos como sidra, como en los innumerables platos exquisitos que se cocinan con ella”. Richard Bradley, (Profesor de Botánica, Cambridge 1724-1733).
El árbol y su fruto
El manzano (Malus domestica) es un árbol frutal, de la familia de las rosáceas (Figuras 1), muy apreciado por su fruto. La manzana, es un pomo globoso, con pedúnculo corto y numerosas semillas de color pardo brillante. En algunas zonas de España se le suele llamar "pero" cuando tiene forma alargada. Las manzanas más precoces maduran en junio, aunque existen variedades que mantienen el fruto durante la mayor parte del invierno e incluso se llegan a recoger en marzo o abril. Es un fruto rico en vitaminas (Figura 2) y con un interesante contenido en fibra alimentaria (celulosa y pectina): de entre 3 a 4,4 gramos por pieza, dependiendo del tamaño. La manzana es rica en flavonoides, como la quercetina, de propiedades antioxidantes, y en taninos, con capacidad astringente y antiinflamatoria, así como en ácidos orgánicos como el ácido málico y el tartárico.
Se supone que, hace más de 15000 años, las variedades silvestres de manzano, de la región comprendida al oeste de las Montañas Tian Shan, en la frontera entre Kazajistán y China, fueron “domesticadas” y comenzaron a cultivarse. El árbol fue introducido en Europa por los romanos y llevado a América por los colonos europeos. Tras siglos de selección y mejora por los cultivadores, el manzano silvestre ha dado lugar a las variedades que hoy conocemos. En la actualidad existen unas 35 especies de manzano reconocidas (Figura 3) y unas 1000 variedades de manzana, como resultado de innumerables hibridaciones entre formas silvestres. Se acepta que, en el origen de los manzanos cultivados actualmente, han participado, por lo menos, las siguientes variedades:
Las flores son grandes, de color rosa pálido y a veces blancas, en número de 3 a 6 unidas. Se abren unos días antes que las hojas, en primavera, generalmente en abril o mayo y son hermafroditas. El manzano tiene una larga vida, que puede llegar hasta los 80 años, dependiendo de la variedad. Es relativamente resistente al frío y puede soportar temperaturas inferiores a los -10ºC, aunque, si desciende por debajo de los -15ºC, pierde algunas yemas florales. Por otra parte, las flores son sensibles a las heladas tardías de la primavera. En realidad es un árbol que precisa un número importante de horas de frío (por encima de 1000 horas), lo que puede variar según la especie. Ello limita en gran medida su cultivo en regiones meridionales. Muchas variedades de manzano son “autoestériles”. Lo que significa que no pueden producir frutos o semillas por si mismos, sin la proximidad de un manzano de otra variedad, al que se denomina “polinizador”. En los listados de variedades frutales se pueden identificar las compatibles entre si. La polinización con polen de otra variedad no afecta a las cualidades del fruto, como el sabor de las manzanas, porque los cambios genéticos afectan solo a las semillas, mientras que las propiedades de las manzanas, por ejemplo las organolépticas, dependen del árbol polinizado (1, 2).
Algo mas que manzanas
A finales del Siglo XVIII, la Ilustración trajo los conocimientos que llevaron al desarrollo de las ciencias experimentales. Las investigaciones en Botánica y Química Orgánica confluyeron para sentar las bases de la terapéutica farmacológica actual. Uno de los grandes retos para los químicos de aquella “edad del pensamiento”, era descubrir y aislar los alcaloides y principios activos de las plantas medicinales. El siguiente paso consistía, una vez aislados, en modificarlos para mejorar sus propiedades y sus efectos terapéuticos.
En 1835, esa búsqueda incansable de nuevos remedios a partir de las plantas, llevó a un grupo de químicos alemanes, belgas y franceses a aislar una sustancia, a partir de la corteza, raíces y brotes verdes del manzano. El hecho de encontrarse mucho mas abundantemente en la corteza de la raíz de la planta llevó a su denominación: phlorizin o phloridzine (florizina en castellano), y también phlorrhizin, phlorhizin, o phlorizoside (en griego: φλοιός= corteza; ρίζα= raíz). Hoy sabemos que la florizina (Sinónimos: 1-[2-(β-D-Glucopyranosyloxy)-4,6-dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-propanone, Phloretin 2′-β-D-glucopyranoside, Phloretin 2′-β-D-glucoside, Phlorizin dihydrate) es un glucosido de la floretina (3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl) propan-1-ona). Más adelante, a la luz de los conocimientos actuales, nos ocupamos de los aspectos moleculares y botánicos de esta sustancia. Ahora vamos a seguir con la interesante historia de su descubrimiento e importancia en la Medicina y la Farmacología.
En un principio, los investigadores extrapolaron las propiedades antipiréticas de los extractos de otros árboles, como el sauce y la cinchona (el árbol de la quina) y, junto a la observación de que el sabor amargo de la florizina era similar al de otros remedios utilizados en el tratamiento de la malaria, se asumió que esta sustancia podría tener también propiedades antipiréticas y podría ser útil en el tratamiento de procesos febriles y enfermedades infecciosas (3).
Todo apunta a que la florizina fue descubierta por Laurent-Guillaume De Koninck (1809-1887) (Figura 4), junto a Jean Servais Stas (1813-1891) (Figura 5). Y la historia parece que fue como sigue:
Jean Servais Stas recibió el título de Doctor en 1835 y se convirtió en asistente de su antiguo profesor de química, Jean-Baptiste Van Mons (1765-1842). El otro asistente de este en la Universidad de Lovaina era De Koninck. Van Mons era un experto en Pomología (rama de la botánica especializada en el estudio, la descripción, identificación y clasificación de las frutas, mas frecuentemente denominada como Fruticultura). Muy reconocido por sus experimentos con árboles frutales, Van Mons tenía un vivero de manzanas y, cuando este vivero necesitó ser desplantado, De Koninck recibió una gran cantidad de raíces frescas de manzano. La colaboración de J. S. Stas y De Koninck dio como resultado el aislamiento, a partir de la corteza de estas raíces, de un glucósido cristalino que denominaron floridzina, que luego se llamaría florizina (4).
De Koninck estudió en Lovaina, donde se graduó en Medicina, Farmacia y Ciencias Naturales. Fue un reconocido paleontólogo, que dedicó muchos esfuerzos al estudio de los fósiles del periodo Carbonífero descubiertos en torno a Lieja. Y sobresalió por sus sus investigaciones de estratigrafía del Paleozoico, en la caliza carbonífera de Bélgica. En reconocimiento a estos trabajos la Geological Society of London le concedió la Medalla Wollaston en 1875. Se convirtió en profesor de paleontología en Lieja. Su biblioteca y su colección de fósiles fue adquirida por Louis Agassiz (1807-1873), y sirvió como base para la biblioteca del Museo de Anatomía Comparada de la Universidad de Harvard. Su principal interés, sin embargo, era la química. Una beca, otorgada por el gobierno belga, le dio la oportunidad de visitar, durante el período de 1834–1835, a dos de los químicos más distinguidos de la época: Gay-Lussac en París y Justus Liebig en Giessen. Por su parte, Jean Servais Stas ingresó en 1837 en el laboratorio del químico francés Jean Baptiste Dumas, en la Escuela Politécnica de París donde continuó la investigación sobre la florizina.
En 1935, en Annalen der Pharmacie, De Koninck publica por primera vez sus hallazgos sobre la florizina (5) (Figuras 6 y 7). Algo después, en los Annales de Chimie et de Physique (Tome LXI, 1836), cuyos editores son Louis Joseph Gay-Lussac y François Jean Dominique Arago, Laurent-Guillaume De Koninck publica su Memoire sur la Phloridzine (Figura 8) (6). En este extenso artículo comienza señalando que extrae la florizina de la cáscara de raíces de rosáceas: peral, ciruelo, cerezo y especialmente manzano. Al extraerla observa que aparece combinada con una sustancia colorante roja, que se haya en proporción inversa a la cantidad de florizina contenida en el extracto. En este sentido, el investigador indica que la menor proporción de la sustancia roja “contaminante” se haya en el manzano (la “sustancia roja” está principalmente compuesta de taninos). Sigue refiriendo De Koninck que, además de en la corteza de las raíces, la florizina se encuentra en la corteza del tronco y de las ramas, especialmente en los brotes jóvenes e incluso en las hojas. Y también observa que la concentración de la sustancia disminuye a medida que la corteza se deshidrata y se seca. La frorizina es descrita como una sustancia cristalina de color blanco mate, que puede llegar a ser amarillento. La cristalización adopta, según De Konick, una disposición en forma de “mechones de seda”. El autor describe las propiedades organolépticas de esta sustancia, como su sabor astringente y amargo, similar al que tienen los brotes o ramas jóvenes, cuando se degustan en fresco. Concretamente dice que la sustancia extraída tiene un sabor “inicialmente algo dulzón que en seguida se nota amargo y finalmente astringente” (6).
A lo largo de su artículo De Koninck explica y desarrolla la técnica de aislamiento y caracterización química de la florizina y cita las aportaciones de otros químicos franceses y alemanes en estas investigaciones, como Philipp Lorenz Geiger (1785-1836) (profesor de farmacia en Heidelberg), Justus von Liebig (1803-1873) (discípulo de Gay-Lussac), Eilhard Mitscherlich (1794-1863) y otros.
Koninck señala en una acotación de su artículo que, en el momento de imprimir su trabajo, tiene noticias de que C. Petersen ha analizado también la florizina (este autor expone su investigación en un artículo publicado en 1835 en Annales Academie Science Francaise) (7) con resultados diferentes a los suyos. De Koninck atribuye estas diferencias a cuestiones técnicas y a la menor pureza de la muestra analizada. En algunos trabajos científicos sobre la florizina se cita el trabajo de Petersen como la primera comunicación sobre el aislamiento de esta sustancia. Sin embargo, las primeras comunicaciones de L. de Koninck sobre la florizina datan de mayo de 1835 y en dicha acotación, de su artículo en Annales de Chimie et de Physique (Tome LXI, 1836), se refiere a que Petersen trabajó en realidad sobre muestras de florizina, que el propio L. De Koninck había enviado al profesor Philipp Lorenz Geiger.
En 1939 Jean Servais Stas, que era ya un químico analítico reputado, publicó también sus propias observaciones sobre la florizina, muchas de ellas compartidas, desde el principio del descubrimiento de la sustancia, con De Koninck. En 1837, se había trasladado a París, donde realizó un estudio detallado sobre la florizina y realizó la separación de la misma en sus dos componentes: floretina y glucosa (8,9).
Florizina y serendipia
A finales del siglo XIX y comienzos del XX hay una rica literatura científica sobre las propiedades glucosúricas de la florizina. Se trata de ensayos realizados en animales y algunos muy anecdóticos en humanos, que observan el aumento de eliminación de glucosa en la orina tras la administración de florizina (por lo común por vía subcutánea). Durante un periodo significativo del siglo XX la florizina se utilizó, además, en pruebas de función renal. Sin embargo, desde las investigaciones pioneras, que incluyen su descubrimiento y aislamiento a partir de la corteza de raiz del manzano, hasta las primeras observaciones sobre su efecto glucosúrico, al final de siglo XIX, pasaron casi 50 años.
El Merck Index, en su edición de 1889 (10) incluye a la florizina como un “Glycosid aus der Wurzelrinde des Apfelbaumes” (“glucósido de la corteza de los manzanos”). Ediciones posteriores señalan que la florizina, en dosis superiores a 1,0 gr., produce glucosuria. Una observación hecha originalmente por J. Von Mering en 1886.
El Barón Josef Von Mering nació en Colonia en 1849 y trabajó como profesor en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Strasburgo que, en esa época, era posiblemente el centro de investigación mejor financiado de Europa. Hecho este que había atraído a sus aulas a una gran cantidad de científicos de primer nivel y, como consecuencia, esta universidad se convirtió en un foco de innovación científica, especialmente en el área de las Ciencias Naturales, la Química, la Física, la Medicina y la Farmacología.
La serendipia (*), entendida no como “pura casualidad”, sino más bien como expresa la frase de Louis Pasteur: “El azar solo favorece a los espíritus preparados” (“Le hasard ne favorise que les esprits préparés”), tuvo mucho que ver con el descubrimiento de las propiedades glucosúricas de la florizina.
Estos hallazgos fueron reproducidos y confirmados por numerosos autores en las dos décadas finales del siglo XIX. Quedando asentado el concepto de que la florizina promueve la excreción urinaria de glucosa y, como consecuencia, reduce el exceso de glucosa circulante en sangre en pacientes diabéticos (16).
Pero el interés de Von Mering por la diabetes va mucho más allá. Y la inflexión definitiva de su carrera como investigador, en área de la diabetes, tiene lugar en su encuentro con Oskar Minkowski (1858-1931). El encuentro tuvo lugar en 1889, en la biblioteca del Instituto de Bioquímica Hoppe-Seylers de Strasburgo. Por aquella época Minkowski era un recien llegado de Königsberg, de donde venía con el profesor Naunyn, que sucedía a Kussmaul en Strasburgo. De aquel primer encuentro nació una estrecha colaboración, que comenzó por el estudio fisiopatológico de la absorción de las grasas realizando la pancreatectomía total de un perro.
Una carta de O. Minkowski de 1929 narra aquel encuentro (17):
Como resultado de la ablación total del páncreas se descubrió la diabetes pancreática. Minkowski repitió el experimento con otros perros para descartar el efecto glucosúrico de la florizina, con que había sido previamente tratado el perro que, en principio, le había facilitado Von Mering. Y tras varios intentos, porque los siguientes perros utilizados en la experimentación, no sobrevivían a la intervención, Minkowski tuvo éxito. Por otra parte, en 1892, Minkowski demostró que la florizina actúa en el riñón. Para ello realizó nefrectomías en perros sanos y pancreatectomizados, señalando cómo, en los animales nefrectomizados, la florizina perdía su efecto hipoglucemiante (18, 19). El descubrimiento del origen pancreático de la diabetes supuso, obviamente, sentar las bases del descubrimiento de la insulina. Y, aunque de eso no nos vamos a ocupar en este artículo, si remitimos a nuestros lectores al minucioso e interesante artículo de De Leiva A. et al. (De Leiva A, Brugués E, De Leiva-Pérez A.. El descubrimiento de la insulina: continúan las controversias después de noventa años. Endocrinol Nutr. 2011;58(9):449-456) (20).
La florizina es un aril beta-D-glucósido que se adhiere a un residuo beta-D-glucopiranosilo en la posición 2' a través de un enlace glucosídico. Se trata de un metabolito vegetal, con propiedades antioxidantes. La florizina pertenece al grupo de los flavonoides y, dentro de ellos, al de las chalconas, y se encuentra principalmente en manzana inmadura y en la corteza de raíz del manzano. En el genus malus, es más abundante en tejidos vegetativos (como hojas y corteza) y semillas. Las especies estrechamente relacionadas, como la pera (Pyrus communis), el cerezo y otros árboles frutales de la familia de las Rosaceae, no contienen florizina. Es un fitoquímico perteneciente a la clase de los polifenoles y, en fuentes naturales, puede concurrir con otros polifenoles como la quercetina, catequina, epicatequina, procianidinas y rutina.
En la base de datos PubChem (base de datos química del National Institutes of Health (NIH)) se señala que la florizina se encuentra en la manzana y se aísla de las hojas y la corteza del manzano. Además se indica que la florizina es un glucósido tóxico producido por algunas plantas, perteneciente al grupo de los flavonoides y añade que es un inhibidor competitivo del transporte renal de glucosa (Figura 17).
Aspectos botánicos de la florizina
La florizina es un glucósido (*) de la floretina (3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl) propan-1-ona) (Figura 14). Se trata de un principio fenólico-glucósido, propio de los manzanos y desempeña importantes funciones en la fisiología del árbol. Estas incluyen un papel como regulador del crecimiento y desarrollo de la planta (41-43).
Por ejemplo, en su forma de aglucon (es decir tras perder el anillo glucosido) la florizina se convierte en floretina, que parece tener también un papel como fungicida (44). Además, la florizina tiene también propiedades protectoras frente a algunas especies de insectos fitopatógenos. En este sentido, se ha mostrado como elemento de disuasión para algunas especies de áfidos (Aphidoidea es una superfamilia de insectos fitopatógenos del suborden Sternorrhyncha, de los que existen cerca de 4.000 especies) que no se alimentan directamente de la manzana (del fruto), como Myzus persicae y Amphorophora agathonica. Aunque no parecía tener efecto, o al menos se mostraba neutral, ante el ataque de otras especies como Aphis pomi o Pulgón verde del manzano (un pequeño insecto chupador que ataca el manzano porque vive a expensas de los jugos que extrae de los brotes tiernos, de donde proviene su nombre común). En realidad, la florizina resultó ser un impedimento para la ingestión de las tres especies, aunque el umbral fue más bajo para A. pomi. La causa de que la manzana pueda ser utilizado como anfitrión por A. pomi, es que este insecto se alimenta en el floema (tejido conductor encargado del transporte de nutrientes orgánicos e inorgánicos —especialmente azúcares— producidos por la parte aérea fotosintética y autótrofa, hacia las partes basales subterráneas, no fotosintéticas, heterótrofas de las plantas vasculares o tubos o vasos liberianos), que parece no contener florizina (45).
El producto de oxidación dimerizado natural de la florizina contribuye al color de los zumos de manzana y las sidras (Figuras 18, 19 y 20). Es importante en las propiedades organolépticas de las sidras, donde puede encontrarse en un rango de concentración de 3 a 16 mg/100 ml, dependiendo de las variedades del cultivo.
La cromatografía líquida de alto rendimiento, ha demostrado también la presencia de florizina en el fruto y en el zumo de manzana, además de su presencia conocida desde hace tiempo en corteza de la raíz, en brotes verdes y en semillas. La cáscara del fruto del manzano contiene entre 12 y 418 mg/kg de florizina, dependiendo de las variedades. La pulpa contiene una menor concentración, que oscila entre 4 y 20 mg/kg. Hay diferencias entre las diferentes variedades: la Golden Delicious tiene la menor concentración mientras que Reineta Verde es la que tiene mayor concentración de florizina (46-48). Por tanto, la florizina es un componente normal en la dieta humana y, como otros flavonoides, las chalconas, grupo al que pertenece la florizina, son metabolitos de numerosas plantas. Además de las manzanas, el té, las uvas, el vino tinto y las cebollas, entre otros muchas, son también importantes fuentes dietéticas de flavonoides.
En un estudio reciente, investigadores europeos realizaron un análisis exhaustivo de estudios científicos previos para investigar la asociación entre la cantidad de floridzina que se encuentra naturalmente en diferentes fuentes de alimentos y la ingesta dietética de estos alimentos en particular (49). El estudio evaluó cinco estudios de cohortes con más de 220000 participantes y alrededor de 14000 casos DM2 entre ellos. Los investigadores identificaron los alimentos que naturalmente contenían florizina y las concentraciones de floridina en cada alimento. También recopilaron datos sobre el consumo de alimentos por parte de personas en países europeos. La información se obtuvo de bases de datos disponibles públicamente. Utilizando la información sobre las concentraciones de florizina en cada alimento y relacionándolas con los datos de consumo, los investigadores calcularon la ingesta de florizina natural por parte de los participantes. el mayor consumo de floridina por parte de los participantes provino de manzanas y jugo de manzana en todos los grupos de población.
El polifenol de manzana, la florizina, puede reducir la absorción de azúcar en el intestino, al inhibir el cotransportador de Na/glucosa 1 (SGLT1). Al investigar la cantidad de florizina en diferentes fuentes de alimentos y vincular Según sus datos de consumo, podríamos estimar el consumo promedio y alto de floridzina en Europa. En promedio, los europeos consumen 0,7–7,5 mg/dia de florizina, los principales contribuyentes son las manzanas y el jugo de manzana. Los consumidores de alto nivel pueden obtener hasta 52 mg/día de florizina.
Según las conclusiones de este estudio el manejo de los niveles de glucosa en sangre podría mejorarse mediante el consumo de florizina, como se ha demostrado en ensayos clínicos recientes. Estos estudios utilizaron extracto de manzana enriquecido con florizina en dosis superiores a las del consumo normal de alimentos. Sin embargo, hay indicios de que el consumo de niveles medios a altos de florizina a través de los alimentos también podría contribuir a una menor carga de azúcar y una reducción en el riesgo de DM2. Los resultados de este estudio sugieren que la ingesta dietética de floridzina puede mejorar el control de los niveles de azúcar en la sangre. Sin embargo, se necesita más investigación para aclarar los posibles beneficios de aumentar la ingesta de alimentos que contienen floridzina y el potencial para reducir el riesgo de diabetes tipo 2. Desde estos puntos de vista, la presencia de florizina en la manzana en una concentración suficientemente elevada convertiria a esta fruta en un interesante alimento funcional (*). Ello abre una interesante vía de investigación nutricional en torno al cultivo de manzanos cuyos frutos tengan un mayor contenido de florizina en su composición nutricional. De hecho existen algunas patentes registradas, dirigidas modificar genéticamente en estas plantas la actividad enzimática que conduce a la formación de florizina en su fruto.
La florizina (phloretin-2'-β-D-glucopyranoside) se convierte en floretina (3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)propan-1-one) en el intestino delgado por acción de las enzimas hidrolíticas, liberando el anillo glucosido. Posteriormente, la enzima floretin-hidrolasa disgrega la floretina en ácido florético y floroglucinol (Figura 20).
El grupo de Semenza (Figura 26), sintetizó diversos derivados de florizina fotosensibles, como marcadores de fotoafinidad, de los puntos de unión al co-transportador de Na+/Glucosa en el borde en cepillo de la membrana del enterocito en intestino delgado:
Los solutos transportados por los miembros del grupo SLC son muy diversos, incluyendo moléculas orgánicas cargadas y no cargadas, iones inorgánicos y amoníaco.Los SLC son cruciales para mantener la homeostasis en el organismo, ya que controlan el tráfico de las moleculas solubles (nutrientes, fármacos y metabolitos) a través de las membranas lipídicas celulares. De los 430 transportadores activos secundarios identificados en humanos, el 30% aun son huérfanos, lo que les convierte en importantes dianas para investigaciones sistemáticas, ya que, muchos de los SLC conocidos, están implicados en varias enfermedades y constituyen posibles dianas farmacológicas (92).
REFERENCIAS:
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| Figura 1. Taxonomía de del genus malus |
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| Figura 2. Valor nutricional de la manzana |
- Malus sylvestris
- Malus orientalis
- Malus sieversii
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| Figura 3 |
A finales del Siglo XVIII, la Ilustración trajo los conocimientos que llevaron al desarrollo de las ciencias experimentales. Las investigaciones en Botánica y Química Orgánica confluyeron para sentar las bases de la terapéutica farmacológica actual. Uno de los grandes retos para los químicos de aquella “edad del pensamiento”, era descubrir y aislar los alcaloides y principios activos de las plantas medicinales. El siguiente paso consistía, una vez aislados, en modificarlos para mejorar sus propiedades y sus efectos terapéuticos.
En 1835, esa búsqueda incansable de nuevos remedios a partir de las plantas, llevó a un grupo de químicos alemanes, belgas y franceses a aislar una sustancia, a partir de la corteza, raíces y brotes verdes del manzano. El hecho de encontrarse mucho mas abundantemente en la corteza de la raíz de la planta llevó a su denominación: phlorizin o phloridzine (florizina en castellano), y también phlorrhizin, phlorhizin, o phlorizoside (en griego: φλοιός= corteza; ρίζα= raíz). Hoy sabemos que la florizina (Sinónimos: 1-[2-(β-D-Glucopyranosyloxy)-4,6-dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-propanone, Phloretin 2′-β-D-glucopyranoside, Phloretin 2′-β-D-glucoside, Phlorizin dihydrate) es un glucosido de la floretina (3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl) propan-1-ona). Más adelante, a la luz de los conocimientos actuales, nos ocupamos de los aspectos moleculares y botánicos de esta sustancia. Ahora vamos a seguir con la interesante historia de su descubrimiento e importancia en la Medicina y la Farmacología.
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| Figura 5. Jean Servais Stas (1813-1891) |
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| Figura 4. Laurent-Guillaume De Koninck (1809-1887) |
Todo apunta a que la florizina fue descubierta por Laurent-Guillaume De Koninck (1809-1887) (Figura 4), junto a Jean Servais Stas (1813-1891) (Figura 5). Y la historia parece que fue como sigue:
Jean Servais Stas recibió el título de Doctor en 1835 y se convirtió en asistente de su antiguo profesor de química, Jean-Baptiste Van Mons (1765-1842). El otro asistente de este en la Universidad de Lovaina era De Koninck. Van Mons era un experto en Pomología (rama de la botánica especializada en el estudio, la descripción, identificación y clasificación de las frutas, mas frecuentemente denominada como Fruticultura). Muy reconocido por sus experimentos con árboles frutales, Van Mons tenía un vivero de manzanas y, cuando este vivero necesitó ser desplantado, De Koninck recibió una gran cantidad de raíces frescas de manzano. La colaboración de J. S. Stas y De Koninck dio como resultado el aislamiento, a partir de la corteza de estas raíces, de un glucósido cristalino que denominaron floridzina, que luego se llamaría florizina (4).
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| Figura 6. Portada de volumen de 1935 de Annalen der Pharmacie. Editado en Heidelberg, donde se publicó el artículo de Laurent-Guillaume De Koninck sobre la florizina |
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Figura 7. Primera página del primer articulo
de De Koninck. Publicado en 1935
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En 1935, en Annalen der Pharmacie, De Koninck publica por primera vez sus hallazgos sobre la florizina (5) (Figuras 6 y 7). Algo después, en los Annales de Chimie et de Physique (Tome LXI, 1836), cuyos editores son Louis Joseph Gay-Lussac y François Jean Dominique Arago, Laurent-Guillaume De Koninck publica su Memoire sur la Phloridzine (Figura 8) (6). En este extenso artículo comienza señalando que extrae la florizina de la cáscara de raíces de rosáceas: peral, ciruelo, cerezo y especialmente manzano. Al extraerla observa que aparece combinada con una sustancia colorante roja, que se haya en proporción inversa a la cantidad de florizina contenida en el extracto. En este sentido, el investigador indica que la menor proporción de la sustancia roja “contaminante” se haya en el manzano (la “sustancia roja” está principalmente compuesta de taninos). Sigue refiriendo De Koninck que, además de en la corteza de las raíces, la florizina se encuentra en la corteza del tronco y de las ramas, especialmente en los brotes jóvenes e incluso en las hojas. Y también observa que la concentración de la sustancia disminuye a medida que la corteza se deshidrata y se seca. La frorizina es descrita como una sustancia cristalina de color blanco mate, que puede llegar a ser amarillento. La cristalización adopta, según De Konick, una disposición en forma de “mechones de seda”. El autor describe las propiedades organolépticas de esta sustancia, como su sabor astringente y amargo, similar al que tienen los brotes o ramas jóvenes, cuando se degustan en fresco. Concretamente dice que la sustancia extraída tiene un sabor “inicialmente algo dulzón que en seguida se nota amargo y finalmente astringente” (6).
A lo largo de su artículo De Koninck explica y desarrolla la técnica de aislamiento y caracterización química de la florizina y cita las aportaciones de otros químicos franceses y alemanes en estas investigaciones, como Philipp Lorenz Geiger (1785-1836) (profesor de farmacia en Heidelberg), Justus von Liebig (1803-1873) (discípulo de Gay-Lussac), Eilhard Mitscherlich (1794-1863) y otros.
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Figura 8. De Koninck, L. Memoire sur la Phloridzine.
En: Annales de Chimie et de Physique. Eds.:
Louis Joseph Gay-Lussac y François
Jean Dominique Arago. Paris (Tome LXI, 1836).
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En 1939 Jean Servais Stas, que era ya un químico analítico reputado, publicó también sus propias observaciones sobre la florizina, muchas de ellas compartidas, desde el principio del descubrimiento de la sustancia, con De Koninck. En 1837, se había trasladado a París, donde realizó un estudio detallado sobre la florizina y realizó la separación de la misma en sus dos componentes: floretina y glucosa (8,9).
Florizina y serendipia
A finales del siglo XIX y comienzos del XX hay una rica literatura científica sobre las propiedades glucosúricas de la florizina. Se trata de ensayos realizados en animales y algunos muy anecdóticos en humanos, que observan el aumento de eliminación de glucosa en la orina tras la administración de florizina (por lo común por vía subcutánea). Durante un periodo significativo del siglo XX la florizina se utilizó, además, en pruebas de función renal. Sin embargo, desde las investigaciones pioneras, que incluyen su descubrimiento y aislamiento a partir de la corteza de raiz del manzano, hasta las primeras observaciones sobre su efecto glucosúrico, al final de siglo XIX, pasaron casi 50 años.
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| Figura 9. Portada de la edición de 1889 del Merck Index |
El Barón Josef Von Mering nació en Colonia en 1849 y trabajó como profesor en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Strasburgo que, en esa época, era posiblemente el centro de investigación mejor financiado de Europa. Hecho este que había atraído a sus aulas a una gran cantidad de científicos de primer nivel y, como consecuencia, esta universidad se convirtió en un foco de innovación científica, especialmente en el área de las Ciencias Naturales, la Química, la Física, la Medicina y la Farmacología.
La serendipia (*), entendida no como “pura casualidad”, sino más bien como expresa la frase de Louis Pasteur: “El azar solo favorece a los espíritus preparados” (“Le hasard ne favorise que les esprits préparés”), tuvo mucho que ver con el descubrimiento de las propiedades glucosúricas de la florizina.
(*) Una serendipia es un descubrimiento o un hallazgo afortunado, valioso e inesperado, que se produce de manera accidental, casual o por destino, o cuando se está buscando una cosa distinta.
El profesor Von Mering se interesó por la florizina medio siglo después de que hubiera sido aislada y analizada y tras un tímido uso médico de la misma basado en supuestas propiedades antipiréticas, que nunca llegaron a sustanciarse. Posiblemente estos antecedentes (tal vez nunca se sepa con certeza la razón exacta) tuvieron que ver con que Von Mering, que estaba interesado por otros muchos temas científicos, entre los que se encontraban la diabetes y la farmacología (entre sus avances se cuenta el desarrollo del barbital, comercialmente denominado Veronal, el primero de los barbitúricos, y también la publicación del primer estudio clínico con paracetamol), decidiera retomar la florizina como sujeto de sus investigaciones farmacológicas. Y, en ese contexto, decidió administrarla a animales de experimentación, en este caso perros. Ello, al parecer, sin ninguna hipótesis previa relacionada con la diabetes (aunque esto quizás nunca lo sabremos con certeza). Tras la administración oral y subcutánea de la florizina descubrió y publicó la aparición de glucosuria en los animales (Von Mering J (1886) Über künstlichen Diabetes; Centralblatt für die medizinische Wissenschaft 22:31). En cualquier caso su interés por la diabetes venía de antes, ya que, después de su estancia en el Instituto de Fisiología en Leipzig, dirigido por el Prof. Ludwig, en 1877 publicó un importante estudio sobre la absorción intestinal y el metabolismo de la glucosa (Von Mering J (1877) Über die Abzugswege des Zuckers aus der Darmhöhle. Arch Anat Physiol 1877: 379–415). Lo que nos lleva de nuevo a “ventaja” de los “espíritus preparados“ para ser favorecidos por la fortuna (9, 11,12,13).
En 1886, en una comunicación de su trabajo al V Congreso de Medicina Interna de Wiesbaden, Von Mering asumió que la florizina actuaba en el riñón de los perros, favoreciendo la eliminación de glucosa (“puede inducir glucosuria al cambiar algo en el riñón", según sus propias palabras) (Von Mering J (1886) Über experimentellen Diabetes; Verhandlungen des V Congresses für Innere Medizin in Wiesbaden. J F Bergmann, Wiesbaden, pp. 185–189). Un año más tarde, en una nueva comunicación (en esta ocasión al VI Congreso de Medicina Interna de Wiesbaden de 1887) informó de que la administración de florizina (en dosis 15-20 gr.), a pacientes diabéticos del departamento de Medicina Interna del profesor Kussmaul, con quien colaboraba, indujo una glucosuria de 6 a 8% (Von Mering J (1887) Über Diabetes mellitus; Verhandlungen des VI Congresses für Innere Medizin in Wiesbaden. J. F. Bergmann, Wiesbaden, pp 349–358). Von Mering diferenció la glucosuria que se produce en la diabetes, por la hiperglucemia, de la glucosuria “florizínica” o “diabetes florizínica”, en la que, por el contrario, la glucemia disminuía como consecuencia de la glucosuria (14,15).
En 1886, en una comunicación de su trabajo al V Congreso de Medicina Interna de Wiesbaden, Von Mering asumió que la florizina actuaba en el riñón de los perros, favoreciendo la eliminación de glucosa (“puede inducir glucosuria al cambiar algo en el riñón", según sus propias palabras) (Von Mering J (1886) Über experimentellen Diabetes; Verhandlungen des V Congresses für Innere Medizin in Wiesbaden. J F Bergmann, Wiesbaden, pp. 185–189). Un año más tarde, en una nueva comunicación (en esta ocasión al VI Congreso de Medicina Interna de Wiesbaden de 1887) informó de que la administración de florizina (en dosis 15-20 gr.), a pacientes diabéticos del departamento de Medicina Interna del profesor Kussmaul, con quien colaboraba, indujo una glucosuria de 6 a 8% (Von Mering J (1887) Über Diabetes mellitus; Verhandlungen des VI Congresses für Innere Medizin in Wiesbaden. J. F. Bergmann, Wiesbaden, pp 349–358). Von Mering diferenció la glucosuria que se produce en la diabetes, por la hiperglucemia, de la glucosuria “florizínica” o “diabetes florizínica”, en la que, por el contrario, la glucemia disminuía como consecuencia de la glucosuria (14,15).
Estos hallazgos fueron reproducidos y confirmados por numerosos autores en las dos décadas finales del siglo XIX. Quedando asentado el concepto de que la florizina promueve la excreción urinaria de glucosa y, como consecuencia, reduce el exceso de glucosa circulante en sangre en pacientes diabéticos (16).
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| Figura 10. Oskar Minkowski (1858-1931) y Josef Von Mering (1849-1908) |
Una carta de O. Minkowski de 1929 narra aquel encuentro (17):
“En
abril de 1889, fui al instituto de bioquímica para leer algunas
publicaciones sobre productos químicos, que no estaban disponibles
en nuestra clínica, y conocí a von Mering en la biblioteca.
Recientemente recomendó Lipantin, una preparación de aceite con un
6% de ácidos grasos libres como reemplazo del aceite de bacalao
porque pensó que los ácidos grasos libres pueden ser la sustancia
más importante que actúa en el aceite de hígado de bacalao.
Von
Mering me preguntó: "¿Utiliza Lipantin con frecuencia en su
clínica?" "Oh, no", le contesté. "Solo les
damos buena mantequilla a nuestros pacientes y no aceite rancio".
"No
te rías", dijo. "Las personas sanas deben metabolizar los
lípidos y, si el páncreas no funciona correctamente, debemos
administrarles los lípidos metabolizados".
"¿Probaste
esto en un experimento?" Le pregunté.
Esta
conversación fue seguida por una discusión sobre cómo hacer el
experimento y, finalmente, Minkowski mencionó que esta pregunta
debería estudiarse en un perro después de una pancreatectomía.
"Esto
no es tan fácil", continuó von Mering, "ya que las
enzimas del páncreas aún pueden penetrar en los intestinos cuando
se realiza una ligadura del conducto pancreático".
"Lo
que quiero decir es que deberíamos extirpar todo el páncreas!"
"Esta
operación es imposible", respondió von Mering.
Como
no sabía sobre la publicación de Claude Bernard que indicaba que
ningún animal sobreviviría a la pancreatectomía total, y debido a
mi corta edad, al estimar mis capacidades como cirujano de
laboratorio, exclamé: "No hay operaciones imposibles. Dame un
perro y hoy le sacaré el páncreas". Von Mehring respondió:
"Está bien, tengo un perro y puedes probarlo". El mismo
día, realicé la pancreatectomía a un perro en el laboratorio de
Naunyn con la ayuda de von Mering. El animal sobrevivió y al
principio parecía estar bien. El día después de la operación, von
Mering tuvo que viajar a Colmar porque su suegro padecía una
neumonía grave. Tuvo que quedarse una semana. Mientras tanto, el
perro, que había sido limpio antes, comenzó a orinar cada vez más
en el laboratorio. Yo reprendí al asistente de laboratorio por no
pasear al perro con la frecuencia suficiente, pero él respondió:
"Lo hago caminar con frecuencia, pero este animal es gracioso".
Tan pronto como regresa, vuelve a orinar, incluso inmediatamente
después de haberlo hecho afuera ". Esta observación me llevó
a examinar la orina del perro”
(Excerpt
from a letter written by Oskar Minkowski describing his discovery and
O. Minkowski (1929) Münchner
Medizinische Wochenschrift 79:311-315) (17).
Como resultado de la ablación total del páncreas se descubrió la diabetes pancreática. Minkowski repitió el experimento con otros perros para descartar el efecto glucosúrico de la florizina, con que había sido previamente tratado el perro que, en principio, le había facilitado Von Mering. Y tras varios intentos, porque los siguientes perros utilizados en la experimentación, no sobrevivían a la intervención, Minkowski tuvo éxito. Por otra parte, en 1892, Minkowski demostró que la florizina actúa en el riñón. Para ello realizó nefrectomías en perros sanos y pancreatectomizados, señalando cómo, en los animales nefrectomizados, la florizina perdía su efecto hipoglucemiante (18, 19). El descubrimiento del origen pancreático de la diabetes supuso, obviamente, sentar las bases del descubrimiento de la insulina. Y, aunque de eso no nos vamos a ocupar en este artículo, si remitimos a nuestros lectores al minucioso e interesante artículo de De Leiva A. et al. (De Leiva A, Brugués E, De Leiva-Pérez A.. El descubrimiento de la insulina: continúan las controversias después de noventa años. Endocrinol Nutr. 2011;58(9):449-456) (20).
Florizina en los albores de la Nefrología
En 1886, cuando Von Mering publica sus hallazgos sobre el efecto glucosúrico de la florizina, la Diabetes Mellitus (DM), que se acompaña de glucosuria, es considerada una enfermedad renal. La administración de florizina provocaba en los animales de experimentación glucosuria y poliuria, además de pérdida de peso, efectos similares a algunos de los “síntomas cardinales” de la DM en humanos. Como ya hemos señalado, Von Mering y Minkowski supieron diferenciar pronto la DM de la “diabetes florizinica” por la falta de hiperglucemia en la segunda. Actualmente se vuelve a dar una gran importancia a los aspectos renales de la enfermedad. Pero no nos adelantemos...
Seguimos en las postrimerías del siglo XIX y comienzos del XX. Los investigadores de la época intentan explicar la fisiopatología del efecto glucosúrico de la florizina, al tiempo que se inicia una intensa actividad investigadora sobre la función renal. Se buscaban modelos reproducibles y aplicables clínicamente para estimar la filtración en la nefrona. En ese contexto, los efectos renales de la florizina fueron valorados y utilizados para estimar la función renal. Varios estudios pusieron de manifiesto la utilidad de esta sustancia como marcador de la función renal, como la abolición del efecto glucosúrico e hipoglucemiante de la florizina, en animales de experimentación, tras inducirles daño renal mediante tóxicos (cantaridina o cromato). De una forma un tanto simplista, se consideraba que, la inducción de glucosuria por la florizina, indicaba que los riñones funcionaban bien (21). Pero, mucho mas allá de estas observaciones, desde principios del siglo XX la florizina se convirtió en uno de los principales recursos para estudiar la función renal, especialmente aprovechando su capacidad para bloquear la reabsorción de glucosa y provocar, por tanto, glucosuria.
En los tratados de Medicina Interna de principios del pasado siglo, dentro de los volúmenes dedicados a las enfermedades renales, las propiedades glucosúricas de la florizina son ya consideradas como una cualidad utilizable en el estudio de la fisiopatología renal. En el Tratado de Medicina de Enriquez, Laffitte, Bergé y Lamy , de 1910, se habla de la “Prueba de la Glucosuria Floridzíca” en los siguientes términos:
En el mismo Tratado de Medicina, al que antes nos hemos referido, en el apartado “Enfermedades de la Nutrición: Diabetes Sacarina” (pag. 704) (23), se puede leer: “...y por medio del empleo de los venenos más diversos (cloroformo, cloral, estricnina, curare, oxido de carbono, ácido carbónico, etc.), es sumamente difícil obtener una diabetes sacarina comparable a la del hombre: la inyección de florizina realiza un síndrome análogo, pero no idéntico; solo la ablación del páncreas determina la aparición de una verdadera diabetes, en la cual la glucosuria permanente va acompañada de polidipsia, de polifagia, de poliuria y de enflaquecimiento”. Y más adelante, en el apartado “Fisiología patológica”, se lee: ”La diabetes pancreática existe indiscutiblemente, puesto que si en un perro, se le extirpa la totalidad del páncreas (Mering y Minkowski), se observa la hiperglicemia, la glucosuria, la azoturia, la poliuria, la polidipsia y el enflaquecimiento característico. Cuando la ablación del páncreas es parcial, la diabetes es ligera. Si se halla conservada la décima parte de la glándula, no se observa ningún síntoma”.
Puede ser interesante hacer un ejercicio mental que, básicamente, consistiría en olvidar los conocimientos actuales y situarnos en la primera década del siglo XX, antes del descubrimiento de la insulina. En esta situación sigamos leyendo el Tratado de Medicina de Enriquez et al. de 1910: “Esta diabetes no es la consecuencia de la supresión del derrame del jugo pancreático en el intestino; no sobreviene después de la ablación de todo el segmento yuxtaduodenal del páncreas (…)…; pues, si se extirpa en parte el páncreas y si se injerta bajo la piel del abdomen un segmento de esta víscera, el animal no es diabético, y solamente lo es cuando se quita este injerto (Mering, Hedon). La supresión del páncreas provoca la diabetes porque el papel de esta glándula es el de modificar la sangre que la atraviesa”. El autor de este apartado del Tratado continúa especulando con los mecanismos por los que el páncreas actúa sobre el metabolismo de la glucosa. Y en este sentido se hace una pregunta. Plantea una cuestión que, por entonces, flotaba en el ánimo de todos los investigadores: “¿Fabrica el páncreas una substancia útil ó destruye una sustancia nociva a la glico-regulación del organismo?”. En dicho Tratado de Medicina de 1910, anterior al descubrimiento de la insulina, el autor va desarrollando, con mayor o menor fidelidad a la verdad que hoy ya conocemos, las teorías fisiopatológicas, plausibles a la luz de los conocimientos de la época. Pero esa es otra historia, sigamos con el papel de la florizina en la diabetes y en otras facetas de la Medicina.
Hacia la década de los 30, se sigue manejando la florizina como herramienta de estudio de la fisiopatología renal. A la par que, los conocimientos sobre la fisiología renal aumentan exponencialmente en esos años, impulsados especialmente por el desarrollo de técnicas mucho más precisas como la micropunción y la microperfusión (Figura 11). Gracias al desarrollo de estas técnicas se pudo cuantificar la presencia de proteínas, glucosa, cloruro, potasio, urea y pH en sangre, en el líquido glomerular y en orina vesical. La comparación de la composición de la sangre con el filtrado glomerular demostró que un fluido acuoso libre de proteínas se separa de la sangre a medida que pasa a través del glomérulo. La ausencia de cloruro de sodio o glucosa en la orina de la vejiga, a pesar de su presencia en sangre y filtrado glomerular, demostró el fenómeno de la reabsorción tubular (24, 25, 26).
Gracias a la depuración de las técnicas de laboratorio comienzan a resolverse en esos años cuestiones como los mecanismos renales de filtrado y de reabsorción de sustancias orgánicas e inorgánicas, así como las zonas del sistema excretor en las que tienen lugar estos fenómenos fisiológicos. El objetivo final es, por supuesto, la estimación de flujo sanguíneo renal y la funcionalidad de glomérulos y túbulos.
En este sentido, se valora la excreción renal de inulina (un polisacárido de elevado peso molecular, compuesto por cadenas de fructosa, presente en la fibra alimentaria y resistente a la acción de la amilasa), por representar fielmente la tasa de filtrado glomerular, ya que esta sustancia no se ve afectada posteriormente en los túbulos, donde no es reabsorbida (en los ensayos de esa década se habla de “coeficiente depuratorio” porque aún no estaba asentado el concepto de “clearance” o aclaramiento, del que hablamos mas adelante). Además ya se sabía que la inulina no puede excretarse en riñones “aglomerulados” de algunos animales (teleósteos). Cuando se compara este efecto entre animales de experimentación (perros y conejos), tratados y no tratados previamente con florizina, no se observa alteración de su eliminación por acción de la florizina. Sin embargo, en el caso de otras sustancias como creatinina, glucosa, xylosa y sacarosa, el efecto de la florizina es aumentar la tasa de excreción hasta acercarse a la de inulina. Se observó que existe una diferencia entre el coeficiente depuratorio de la creatinina en animales de experimentación como el perro y el conejo, en los que es equivalente a la de la inulina y en humanos y en simios, donde ambos “coeficientes” se aproximan en el caso de aumento de la concentración plásmática de creatinina, por un aumento de la filtración.
Además, para la glucosa, se objetiva la intervención exclusiva de los túbulos proximales, donde se produce la inhibición de la resorción por la florizina, además de la del cloro. Walker y Hudson mostraron que la glucosa se reabsorbió del túbulo contorneado proximal, pero no del túbulo contorneado distal en anfibios (Necturus y ranas) (Figura 12). La reabsorción de glucosa se redujo por aumentos en la velocidad de flujo del túbulo o hiperglucemia, pero era claramente inhibida por acción de la florizina (27, 28, 29).
Seguimos en las postrimerías del siglo XIX y comienzos del XX. Los investigadores de la época intentan explicar la fisiopatología del efecto glucosúrico de la florizina, al tiempo que se inicia una intensa actividad investigadora sobre la función renal. Se buscaban modelos reproducibles y aplicables clínicamente para estimar la filtración en la nefrona. En ese contexto, los efectos renales de la florizina fueron valorados y utilizados para estimar la función renal. Varios estudios pusieron de manifiesto la utilidad de esta sustancia como marcador de la función renal, como la abolición del efecto glucosúrico e hipoglucemiante de la florizina, en animales de experimentación, tras inducirles daño renal mediante tóxicos (cantaridina o cromato). De una forma un tanto simplista, se consideraba que, la inducción de glucosuria por la florizina, indicaba que los riñones funcionaban bien (21). Pero, mucho mas allá de estas observaciones, desde principios del siglo XX la florizina se convirtió en uno de los principales recursos para estudiar la función renal, especialmente aprovechando su capacidad para bloquear la reabsorción de glucosa y provocar, por tanto, glucosuria.
En los tratados de Medicina Interna de principios del pasado siglo, dentro de los volúmenes dedicados a las enfermedades renales, las propiedades glucosúricas de la florizina son ya consideradas como una cualidad utilizable en el estudio de la fisiopatología renal. En el Tratado de Medicina de Enriquez, Laffitte, Bergé y Lamy , de 1910, se habla de la “Prueba de la Glucosuria Floridzíca” en los siguientes términos:
"Prueba de la glucosuria floridzíca: Achard y Delamare (16) inyectan debajo de la piel un centímetro cúbico de una solución de floridzina al 1 por 200, y recogen la orina cada media hora y luego cada hora. En un sujeto sano la glucosuria aparece al cabo de media hora, aumenta, y luego desaparece al cabo de tres a cuatro horas. La cantidad de glucosa urinaria varia entre 1 y 3 gramos. En la nefritis, la glucosuria floridzíca es a menudo irregular y a veces nula. Desgraciadamente esta glucosuria, cuyo mecanismo íntimo desconocemos, es a veces normal en sujetos con uremia inminente" (22).Hay que tener en cuenta que la primera década del siglo pasado fue un periodo en el que aún se estaba asimilando el origen pancreático de la DM. Y, por otra parte, existían grandes lagunas de conocimiento en lo relativo a la fisiopatología de la enfermedad, especialmente en cuanto a las implicaciones renales de la misma.
En el mismo Tratado de Medicina, al que antes nos hemos referido, en el apartado “Enfermedades de la Nutrición: Diabetes Sacarina” (pag. 704) (23), se puede leer: “...y por medio del empleo de los venenos más diversos (cloroformo, cloral, estricnina, curare, oxido de carbono, ácido carbónico, etc.), es sumamente difícil obtener una diabetes sacarina comparable a la del hombre: la inyección de florizina realiza un síndrome análogo, pero no idéntico; solo la ablación del páncreas determina la aparición de una verdadera diabetes, en la cual la glucosuria permanente va acompañada de polidipsia, de polifagia, de poliuria y de enflaquecimiento”. Y más adelante, en el apartado “Fisiología patológica”, se lee: ”La diabetes pancreática existe indiscutiblemente, puesto que si en un perro, se le extirpa la totalidad del páncreas (Mering y Minkowski), se observa la hiperglicemia, la glucosuria, la azoturia, la poliuria, la polidipsia y el enflaquecimiento característico. Cuando la ablación del páncreas es parcial, la diabetes es ligera. Si se halla conservada la décima parte de la glándula, no se observa ningún síntoma”.
Puede ser interesante hacer un ejercicio mental que, básicamente, consistiría en olvidar los conocimientos actuales y situarnos en la primera década del siglo XX, antes del descubrimiento de la insulina. En esta situación sigamos leyendo el Tratado de Medicina de Enriquez et al. de 1910: “Esta diabetes no es la consecuencia de la supresión del derrame del jugo pancreático en el intestino; no sobreviene después de la ablación de todo el segmento yuxtaduodenal del páncreas (…)…; pues, si se extirpa en parte el páncreas y si se injerta bajo la piel del abdomen un segmento de esta víscera, el animal no es diabético, y solamente lo es cuando se quita este injerto (Mering, Hedon). La supresión del páncreas provoca la diabetes porque el papel de esta glándula es el de modificar la sangre que la atraviesa”. El autor de este apartado del Tratado continúa especulando con los mecanismos por los que el páncreas actúa sobre el metabolismo de la glucosa. Y en este sentido se hace una pregunta. Plantea una cuestión que, por entonces, flotaba en el ánimo de todos los investigadores: “¿Fabrica el páncreas una substancia útil ó destruye una sustancia nociva a la glico-regulación del organismo?”. En dicho Tratado de Medicina de 1910, anterior al descubrimiento de la insulina, el autor va desarrollando, con mayor o menor fidelidad a la verdad que hoy ya conocemos, las teorías fisiopatológicas, plausibles a la luz de los conocimientos de la época. Pero esa es otra historia, sigamos con el papel de la florizina en la diabetes y en otras facetas de la Medicina.
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| Figura 11. Técnicas de investigación de la función renal desarrolladas en la década de los años 30 del Siglo XX. |
Gracias a la depuración de las técnicas de laboratorio comienzan a resolverse en esos años cuestiones como los mecanismos renales de filtrado y de reabsorción de sustancias orgánicas e inorgánicas, así como las zonas del sistema excretor en las que tienen lugar estos fenómenos fisiológicos. El objetivo final es, por supuesto, la estimación de flujo sanguíneo renal y la funcionalidad de glomérulos y túbulos.
En este sentido, se valora la excreción renal de inulina (un polisacárido de elevado peso molecular, compuesto por cadenas de fructosa, presente en la fibra alimentaria y resistente a la acción de la amilasa), por representar fielmente la tasa de filtrado glomerular, ya que esta sustancia no se ve afectada posteriormente en los túbulos, donde no es reabsorbida (en los ensayos de esa década se habla de “coeficiente depuratorio” porque aún no estaba asentado el concepto de “clearance” o aclaramiento, del que hablamos mas adelante). Además ya se sabía que la inulina no puede excretarse en riñones “aglomerulados” de algunos animales (teleósteos). Cuando se compara este efecto entre animales de experimentación (perros y conejos), tratados y no tratados previamente con florizina, no se observa alteración de su eliminación por acción de la florizina. Sin embargo, en el caso de otras sustancias como creatinina, glucosa, xylosa y sacarosa, el efecto de la florizina es aumentar la tasa de excreción hasta acercarse a la de inulina. Se observó que existe una diferencia entre el coeficiente depuratorio de la creatinina en animales de experimentación como el perro y el conejo, en los que es equivalente a la de la inulina y en humanos y en simios, donde ambos “coeficientes” se aproximan en el caso de aumento de la concentración plásmática de creatinina, por un aumento de la filtración.
Además, para la glucosa, se objetiva la intervención exclusiva de los túbulos proximales, donde se produce la inhibición de la resorción por la florizina, además de la del cloro. Walker y Hudson mostraron que la glucosa se reabsorbió del túbulo contorneado proximal, pero no del túbulo contorneado distal en anfibios (Necturus y ranas) (Figura 12). La reabsorción de glucosa se redujo por aumentos en la velocidad de flujo del túbulo o hiperglucemia, pero era claramente inhibida por acción de la florizina (27, 28, 29).
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Figura 12. Efecto de la florizina, en
animales de experimentación (anfíbios: anuros y ranas), sobre
diferentes tramos del sistema excretor renal, donde se observa cómo,
la mayor concentración de sustancias reductoras, ocurre en el tramo
final de túbulo contorneado proximal de los animales a los que se ha
administrado florizina (Walker,
A.M., Hudson, C. L.. The reabsorption of glucose from the renal
tubule in amphibia and the action of phlorizin upon it. Am J Physiol
1936; 118:
130-143) (30).
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En la introducción del capítulo III de la obra Renal Physiology. People and Ideas, cuyo título es “Clearance Concept in Renal Physiology”, escrito por Stanley E. Bradley (31), el autor comenta, al referirse al origen del concepto de “aclaramiento renal” (“clearance”), cómo en 1928 el grupo de Van Slyke introduce este concepto esencial de la Nefrología. El concepto indica la producción urinaria de urea por minuto en relación con su concentración en sangre, definiéndola como el volumen de sangre completamente "aclarado" (en el sentido de “limpiado”), de urea por minuto, cuando el flujo de orina supera los 2 ml/min (32).
En el mismo Capítulo III del artículo de Bradley, se señala cómo, en 1933 Homer Smith escribía: “En mi opinión, esta palabra (“clearance” o “aclaramiento”) ha sido más útil para la fisiología renal que todas las ecuaciones que se han escrito. En los últimos años se ha desprendido de la excreción de urea y, tomando alas conceptuales, se ha convertido en una noción generalizada aplicable a todos los aspectos de la excreción renal...”
Uno de los hitos en la utilización de la florizina como prueba de función renal tiene lugar en 1933. En esa fecha, precisamente el grupo de Homer Smith (Figura 13), utilizando la administración intravenosa de florizina, para producir glucosuria en sujetos normales, desarrolla un método eficaz para estimar, de forma no invasiva, el filtrado glomerular y el flujo sanguíneo renal. Con estos estudios contribuyeron al desarrollo de las bases del conocimiento de la hemodinámica renal y del transporte tubular renal (33, 34).
En su trabajo de 1933, Chasis, Jolliffe y Smith hace una recopilación de los ensayos realizados con la florizina desde su descubrimiento hasta esa fecha. Por ello nos parece especialmente ilustrativa la tabla que exponemos, tomada de dicho artículo del J Clin Invest. En ella aparecen recogidos desde 1836 a 1933 diversos ensayos en humanos, dosis y vías de administración de la florizina (33) (Figuras 14 y 15).
Smith señala en su trabajo que la florizina se puede administrar con seguridad por vía intravenosa a los seres humanos. Y enumera experiencias anteriores con administración tanto oral: Hasta 15 gramos, en una sola dosis, utilizados en las experiencias de Pietkiewicz y Von Mering, en 1869 y 1889, respectivamente; o las tres dosis orales de 5 gramos en un día, diluidos en alcohol, referidas por Korte en 1896. Von Mering reporta también su uso por vía parenteral (2 gramos en inyección subcutánea, en solución acuosa tibia, un gramo cada 12 horas durante 30 días) en un caso de sarcoma (mas adelante en este artículo, cuando nos referimos a los Aspectos Farmacológicos de la florizina, señalamos que ha sido probada en el tratamiento de tumores). Además, llama la atención sobre que en ninguno de los casos se registró daño permanente (33, 35, 36).
Observaciones previas del grupo de Homer Smith habían demostrado que, en animales de experimentación (perros), dosis adecuadas de florizina elevaban el aclaramiento de glucosa y reducían el aclaramiento de creatinina al nivel del aclaramiento de xylosa. A partir de estos resultados los mismos autores se plantean si se producirían cambios similares en humanos. Señalan que la utilización de dosis en el rango de 2.0 a 65.0 mg./kg no mostraban en humanos ninguna reacción adversa, “salvo una aparente disminución de la actividad glomerular con las dosis más elevadas” (hoy sabemos que con los nuevos fármacos derivados de la florizina se produce una disminución del flujo glomerular por ligera vasoconstricción de la arteriola aferente del glomérulo). Además, tras utilizar diferentes dosificaciones, una pequeña dosis de florizina elevaría el aclaramiento de glucosa hasta el aclaramiento de xylosa, mientras que dosis más grandes elevarían la primera definitivamente por encima de la segunda.
Los trabajos de Poulsson y del grupo de Homer Smith pusieron de manifiesto la inhibición de la reabsorción de glucosa por la florizina (37, 38).
En el trabajo del grupo de Homer Smith se maneja el concepto de “florizinación completa” (“complete phlorizination”). Es decir, un cambio en la actividad renal, por el cual toda la glucosa filtrada en los glomérulos puede pasar a la orina. Lo que indicaría un bloqueo completo de la reabsorción tubular de glucosa. En este sentido, los autores se inclinan por utilizar preferiblemente los términos “complete glycuresis” (algo así como “glucosuria completa”), para designar el significativo aumento de la tasa de excreción de glucosa, en lugar de una simple presencia de trazas de la misma en la orina. A la vista de sus resultados consideran que, la dosis mínima de florizina intravenosa en humanos, requerida para alcanzar la “florizinación completa” (es decir el bloqueo completo de reabsorción de glucosa) oscilaría en el rango de 10 a 20 mg/kg. Y, por otra parte, la inyección de florizina no produce aumento del aclaramiento de xylosa o sucrosa, lo que parece indicar la selectividad de la acción de bloqueo de la reabsorción de glucosa. Además, en el rango de dosis elevadas (hasta 65 mg/kg) no se produce un descenso del ratio de aclaramiento de creatinina/xylosa.
Al nivel de conocimientos de esa época (años 30 del pasado siglo) se hace ya “posible averiguar no solo la cuantía del filtrado glomerular, sino determinar qué sustancias del filtrado se resorben en los tubuli, por la comparación de los valores de los coeficientes depuratorios de la inulina” (39).
En 1935 J. A. Shannon y H. W. Smith publican un importante trabajo en el que se examina la excreción de inulina en humanos. Tras la inyección intravenosa de este polisacárido, se compara la tasa de aclaramiento de inulina simultáneamente con la de urea, glucosa y xylosa, tanto en sujetos “normales” como “florizinizados”, según terminología de los propios autores. Llegan a la conclusión de que los mamíferos no excretan carbohidratos y que la inulina no es una excepción y no es excretada en los túbulos renales, ni su aclaramiento se ve afectada en los sujetos tratados con florizina. La xylosa y la sacarosa normalmente es reabsorbida por los túbulos renales del filtrado glomerular y esta reabsorción es en parte un proceso activo que, en parte, es eliminado por la florizina. Observandose en ese caso una eliminación de xylosa en la orina similar a la de inulina (40).
Aspectos bioquímicos de la florizina
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| Figura 13. Homer William Smith (1895–1962) |
Uno de los hitos en la utilización de la florizina como prueba de función renal tiene lugar en 1933. En esa fecha, precisamente el grupo de Homer Smith (Figura 13), utilizando la administración intravenosa de florizina, para producir glucosuria en sujetos normales, desarrolla un método eficaz para estimar, de forma no invasiva, el filtrado glomerular y el flujo sanguíneo renal. Con estos estudios contribuyeron al desarrollo de las bases del conocimiento de la hemodinámica renal y del transporte tubular renal (33, 34).
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| Figura 14 |
Smith señala en su trabajo que la florizina se puede administrar con seguridad por vía intravenosa a los seres humanos. Y enumera experiencias anteriores con administración tanto oral: Hasta 15 gramos, en una sola dosis, utilizados en las experiencias de Pietkiewicz y Von Mering, en 1869 y 1889, respectivamente; o las tres dosis orales de 5 gramos en un día, diluidos en alcohol, referidas por Korte en 1896. Von Mering reporta también su uso por vía parenteral (2 gramos en inyección subcutánea, en solución acuosa tibia, un gramo cada 12 horas durante 30 días) en un caso de sarcoma (mas adelante en este artículo, cuando nos referimos a los Aspectos Farmacológicos de la florizina, señalamos que ha sido probada en el tratamiento de tumores). Además, llama la atención sobre que en ninguno de los casos se registró daño permanente (33, 35, 36).
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Figura 15. Ensayos clinicos con florizina entre 1836 y 1933.
Chassis, Jolliffe y Smith (33)
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Los trabajos de Poulsson y del grupo de Homer Smith pusieron de manifiesto la inhibición de la reabsorción de glucosa por la florizina (37, 38).
En el trabajo del grupo de Homer Smith se maneja el concepto de “florizinación completa” (“complete phlorizination”). Es decir, un cambio en la actividad renal, por el cual toda la glucosa filtrada en los glomérulos puede pasar a la orina. Lo que indicaría un bloqueo completo de la reabsorción tubular de glucosa. En este sentido, los autores se inclinan por utilizar preferiblemente los términos “complete glycuresis” (algo así como “glucosuria completa”), para designar el significativo aumento de la tasa de excreción de glucosa, en lugar de una simple presencia de trazas de la misma en la orina. A la vista de sus resultados consideran que, la dosis mínima de florizina intravenosa en humanos, requerida para alcanzar la “florizinación completa” (es decir el bloqueo completo de reabsorción de glucosa) oscilaría en el rango de 10 a 20 mg/kg. Y, por otra parte, la inyección de florizina no produce aumento del aclaramiento de xylosa o sucrosa, lo que parece indicar la selectividad de la acción de bloqueo de la reabsorción de glucosa. Además, en el rango de dosis elevadas (hasta 65 mg/kg) no se produce un descenso del ratio de aclaramiento de creatinina/xylosa.
Al nivel de conocimientos de esa época (años 30 del pasado siglo) se hace ya “posible averiguar no solo la cuantía del filtrado glomerular, sino determinar qué sustancias del filtrado se resorben en los tubuli, por la comparación de los valores de los coeficientes depuratorios de la inulina” (39).
En 1935 J. A. Shannon y H. W. Smith publican un importante trabajo en el que se examina la excreción de inulina en humanos. Tras la inyección intravenosa de este polisacárido, se compara la tasa de aclaramiento de inulina simultáneamente con la de urea, glucosa y xylosa, tanto en sujetos “normales” como “florizinizados”, según terminología de los propios autores. Llegan a la conclusión de que los mamíferos no excretan carbohidratos y que la inulina no es una excepción y no es excretada en los túbulos renales, ni su aclaramiento se ve afectada en los sujetos tratados con florizina. La xylosa y la sacarosa normalmente es reabsorbida por los túbulos renales del filtrado glomerular y esta reabsorción es en parte un proceso activo que, en parte, es eliminado por la florizina. Observandose en ese caso una eliminación de xylosa en la orina similar a la de inulina (40).
Aspectos bioquímicos de la florizina
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Figura 16. La florizina es un glucosido de la floretina
(3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)
propan-1-ona). Sinónimos de la florizina:
1-[2-(β-D-Glucopyranosyloxy)-4,6-dihydroxyphenyl]-3-
(4-hydroxyphenyl)-1-propanone, Floretin
2′-β-D-glucopiranosido, Floretin 2′-β-D-glucoside,
Florizin dihidrato.
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En la base de datos PubChem (base de datos química del National Institutes of Health (NIH)) se señala que la florizina se encuentra en la manzana y se aísla de las hojas y la corteza del manzano. Además se indica que la florizina es un glucósido tóxico producido por algunas plantas, perteneciente al grupo de los flavonoides y añade que es un inhibidor competitivo del transporte renal de glucosa (Figura 17).
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| Figura 17. Hoja de datos y referencias moleculares de florizina en la base de datos de PubChem |
Aspectos botánicos de la florizina
La florizina es un glucósido (*) de la floretina (3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl) propan-1-ona) (Figura 14). Se trata de un principio fenólico-glucósido, propio de los manzanos y desempeña importantes funciones en la fisiología del árbol. Estas incluyen un papel como regulador del crecimiento y desarrollo de la planta (41-43).
(*) Los glucósidos son moléculas compuestas por un glúcido (generalmente monosacáridos) y un compuesto no glucídico. Los glucósidos desempeñan numerosos papeles importantes en los organismos vivos. Muchas plantas almacenan los productos químicos importantes en forma de glucósidos inactivos; si estos productos químicos son necesarios, se hidrolizan en presencia de agua y una enzima, generando azúcares importantes en el metabolismo de la planta. Muchos glucósidos de origen vegetal son conocidos por sus propiedades farmacológicas. En la Tabla I se recogen algunos ejemplos de glucósidos y sus fuentes naturales.
Tabla I. Algunos glucósidos naturales
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Glucosido
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Productos hidrolíticos
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Fuente natural
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Arbutina
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Glucosa + hidroquinona
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Madroño
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Florizina
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Glucosa + floretina
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Genus Malus
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Amigdalina
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2Glucosa + D-mandelonitrilo
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Almendras amargas
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Digitonina
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4Galactosa + xilosa + digitogenina
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Digitalis purpurea
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Saponina
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Carbohidrato + sapogenina
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Hierba jabonera
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Indicán
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Glucosa + indoxilo
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Hojas de indigofera
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Glucósido de Quercetina
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Glucosa + quercetina
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Cebolla
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Rutina
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Rutinosa + quercetina
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Esparrago, ruibarbo
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Aspectos nutricionales de la florizina
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| Figura 18. |
La cromatografía líquida de alto rendimiento, ha demostrado también la presencia de florizina en el fruto y en el zumo de manzana, además de su presencia conocida desde hace tiempo en corteza de la raíz, en brotes verdes y en semillas. La cáscara del fruto del manzano contiene entre 12 y 418 mg/kg de florizina, dependiendo de las variedades. La pulpa contiene una menor concentración, que oscila entre 4 y 20 mg/kg. Hay diferencias entre las diferentes variedades: la Golden Delicious tiene la menor concentración mientras que Reineta Verde es la que tiene mayor concentración de florizina (46-48). Por tanto, la florizina es un componente normal en la dieta humana y, como otros flavonoides, las chalconas, grupo al que pertenece la florizina, son metabolitos de numerosas plantas. Además de las manzanas, el té, las uvas, el vino tinto y las cebollas, entre otros muchas, son también importantes fuentes dietéticas de flavonoides.
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| Figura 19. Escanciado de la sidra |
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| Figura 20. Manzanas de la D.O.P. "Sidra de Asturias" |
Según las conclusiones de este estudio el manejo de los niveles de glucosa en sangre podría mejorarse mediante el consumo de florizina, como se ha demostrado en ensayos clínicos recientes. Estos estudios utilizaron extracto de manzana enriquecido con florizina en dosis superiores a las del consumo normal de alimentos. Sin embargo, hay indicios de que el consumo de niveles medios a altos de florizina a través de los alimentos también podría contribuir a una menor carga de azúcar y una reducción en el riesgo de DM2. Los resultados de este estudio sugieren que la ingesta dietética de floridzina puede mejorar el control de los niveles de azúcar en la sangre. Sin embargo, se necesita más investigación para aclarar los posibles beneficios de aumentar la ingesta de alimentos que contienen floridzina y el potencial para reducir el riesgo de diabetes tipo 2. Desde estos puntos de vista, la presencia de florizina en la manzana en una concentración suficientemente elevada convertiria a esta fruta en un interesante alimento funcional (*). Ello abre una interesante vía de investigación nutricional en torno al cultivo de manzanos cuyos frutos tengan un mayor contenido de florizina en su composición nutricional. De hecho existen algunas patentes registradas, dirigidas modificar genéticamente en estas plantas la actividad enzimática que conduce a la formación de florizina en su fruto.
Propiedades antioxidantes de la florizina(*) Alimentos funcionales son aquellos que no solo son apreciados por sus características nutricionales, sino también para cumplir una función específica como puede ser el mejorar la salud y reducir el riesgo de contraer enfermedades.
La florizina (phloretin-2'-β-D-glucopyranoside) se convierte en floretina (3-(4-Hydroxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)propan-1-one) en el intestino delgado por acción de las enzimas hidrolíticas, liberando el anillo glucosido. Posteriormente, la enzima floretin-hidrolasa disgrega la floretina en ácido florético y floroglucinol (Figura 20).
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| Figura 21. Hidrolisis de la florizina en glucosa y floretina |
Los flavonoides, como la florizina, son compuestos polifenólicos con propiedades antioxidantes. Manzanas, té, uvas, el vino tinto y las cebollas son otras importantes fuentes dietéticas de flavonoides.
Sin embargo, el potencial antioxidante puede no ser siempre beneficioso, ya que los fenómenos de apoptosis pueden necesitar del daño oxidativo. Muchas células cancerosas presentan estrés oxidativo, pero no pueden lograr un evento apoptótico. Ello puede sugerir una insuficiente actividad pro-oxidativa. En ese sentido el potencial antioxidante de algunas sustancias podría, potencialmente, obstaculizar procesos celulares destructivos (apostóticos) importantes. Sin embargo, los flavonoides superan esta aparente paradoja, ya que exhiben propiedades antioxidantes a la vez que limitan la división celular y destruyen los tumores.
Un mecanismo que puede explicar esto es la "fenolización" irreversible (unión covalente de flavonoides a través de la formación de o-quinona/semi-quinona) de las proteínas ciclina (proteinas involucradas en la regulación del ciclo celular), que contrasta con la fosforilación reguladora y reversible habitual. Una posibilidad particular con respecto a esto es la "fenolización" de tyr-15 expuesto en p34 Cdc2 ("cell division control protein 2 homolog" o kinasa dependiente de Ciclina 1) que conduciría a la detención de la fase G2-M de la mitosis (fase de crecimiento celular) (Figura 22); la fosforilación en este punto es un factor de control. Por ejemplo, se sabe que la quercetina (un flavonoide muy abundante en la cebolla, especialmente en la variedad roja. Ver tabla I) interrumpe la fase G2-M (Figura 21) de la línea celular MDA-MB468 del cáncer de mama (50, 51).
En cualquier caso, los flavonoides, en general, han demostrado un importante efecto antioxidante y eliminador de aniones superóxido, de radicales lipídicos peróxido y de iones metálicos (52-55).
Las observaciones epidemiológicas sugieren que el consumo de alimentos ricos en flavonoides tiene una relación inversa con la prevalencia de enfermedad coronaria (55, 56) y varios estudios sugieren que la florizina puede explicar parcialmente esta relación (57, 58).
En relación con esto, en algunas observaciones, la florizina ha demostrado ser un inhibidor más potente de la peroxidación lipídica que el 17-β estradiol. Tanto el zumo, como otros extractos de manzana, contienen florizina con un 11 a 36% de concentración total de fenoles, capaces de inhibir la oxidación lipoproteinas de baja densidad (LDL) (59). Además, se ha demostrado que la floretina (el aglucón de la florizina) produce relajación endotelial in vitro de aislados de anillos de arterias coronarias, en baño de órganos (60)
Efectos mitocondriales de la florizina
En la década de los 50 del pasado siglo, los estudios sobre el mecanismo de acción de la florizina se centraron en el efecto celular y molecular. Inicialmente, se observó que altas concentraciones de florizina (5 X 10−4 a 10−3 M) producen inhibición del metabolismo aeróbico por reducción de la eficiencia de la fosforilación oxidativa y además induce alteración de la estructura mitocondrial produciendo edema. Ambos fenómenos ocurren también en el curso de los llamados procesos de envejecimiento mitocondrial. Según varios estudios, realizados a lo largo de dicha década, la florizina parece agruparse con otros agentes capaces de iniciar dicho proceso (fostato inorgánico, iones Mn++, 2,4-dinitrofenol, etcétera). Los efectos a nivel mitocondrial parecen comprender además una disminución de la capacidad de concentración de ciertos iones y nucleótidos, el descenso del intercambio fostato-oxígeno, así como la aparición de DPN-asa y de ATPasa magnesio-dependientes (61-65).
Algunos de estos efectos mitocondriales de la florizina se han descrito en relación con su acción en los túbulos renales. Por ejemplo se ha demostrado que las mitocondrias renales de animales tratados de forma crónica con florizina presentan una reducción de la eficiencia de la fosforilación oxidativa. Por otra parte, la presencia de edema turbio en túbulos contorneados renales, en animales tratados con florizina, se ha relacionado con el edema mitocondrial que, en suficiente concentración, puede causar alteración estructural mitocondrial in vivo. Los efectos mitocondriales de la florizina son menos evidentes en presencia de ATP, ADP y malonato, y en las condiciones metabólicas que se producen cuando la florizina alcanza la mitocondria en presencia de ATP y α-cetoglutarato. Se observó que las alteraciones estructurales mitocondriales se relacionan bien con el efecto de estos agentes y con las condiciones en que la florizina induce la inhibición de los fenómenos oxidativos.
En animales de experimentación (perros) se observó que, la infusión continua de florizina en dosis pequeñas (0.6–100 µg/kg/min.), reduce la velocidad máxima de transporte de glucosa (Tm g) en un 20–70%. La florizina se mostraba, pues, como un inhibidor poderoso del transporte de glucosa. Los autores de estos experimentos concluían que, las concentraciones efectivas de florizina en el animal, son del mismo rango que las que alteran el transporte de glucosa y el metabolismo oxidativo in vitro. Sin embargo, el aumento de la tasa de infusión de florizina (incluso hasta 100 µg/Kg/min) no supuso la inhibición completa del transporte de glucosa (66, 67).
La florizina y su herencia
Con la ayuda de la florizina, las investigaciones sobre la inhibición del transporte de azúcares, a través de las membranas, condujeron a la identificación del mecanismo de transporte acoplado de sodio y glucosa. A ello siguió la caracterización de los cotransportadores de sodio/glucosa (SGLT). Lógicamente, la inhibición de dichos cotransportadores se convirtió en un objetivo potencial en la terapia de la diabetes.
En la Figura 24 se expone el modelo propuesto por Crane. La glucosa, liberada de la sacarosa de la dieta, es transportada a través de la membrana plasmática por un complejo portador de sodio y glucosa. El transporte de glucosa es impulsado por el gradiente interno de Na+ mantenido por la bomba de Na+. La estrofantidina inhibe la bomba de Na+ eliminando la fuerza impulsora para el transporte cuesta arriba de glucosa. La florizina, un glucósido vegetal, inhibe directamente el cotransporte. Este esquema simple explica el transporte de glucosa a través de la membrana del borde en cepillo intestinal y el requisito de entrada de energía desde la célula. El modelo sigue siendo válido hasta el día de hoy, aunque posteriormente se ha determinado el sitio de inhibición de la florizina que es extracelular, asi como la ubicación de la bomba de Na+/K +, situada en la membrana basolateral. Se acuñó el término symport para definir este tipo de transporte acoplado. También se demostró que el transporte activo de iones y moléculas en plantas y bacterias se debe al symport con protones, como cationes impulsores. Así mismo se identificaron los simportadores de Na+ en bacterias y los simportadores de H+ en mamíferos (68, 69, 70, 71).
Sin embargo, el potencial antioxidante puede no ser siempre beneficioso, ya que los fenómenos de apoptosis pueden necesitar del daño oxidativo. Muchas células cancerosas presentan estrés oxidativo, pero no pueden lograr un evento apoptótico. Ello puede sugerir una insuficiente actividad pro-oxidativa. En ese sentido el potencial antioxidante de algunas sustancias podría, potencialmente, obstaculizar procesos celulares destructivos (apostóticos) importantes. Sin embargo, los flavonoides superan esta aparente paradoja, ya que exhiben propiedades antioxidantes a la vez que limitan la división celular y destruyen los tumores.
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| Figura 22. Fases del ciclo de mitosis celular. Punto de la fase G2-M de la mitosis donde actúa el flavonoide quercetina. |
En cualquier caso, los flavonoides, en general, han demostrado un importante efecto antioxidante y eliminador de aniones superóxido, de radicales lipídicos peróxido y de iones metálicos (52-55).
Las observaciones epidemiológicas sugieren que el consumo de alimentos ricos en flavonoides tiene una relación inversa con la prevalencia de enfermedad coronaria (55, 56) y varios estudios sugieren que la florizina puede explicar parcialmente esta relación (57, 58).
En relación con esto, en algunas observaciones, la florizina ha demostrado ser un inhibidor más potente de la peroxidación lipídica que el 17-β estradiol. Tanto el zumo, como otros extractos de manzana, contienen florizina con un 11 a 36% de concentración total de fenoles, capaces de inhibir la oxidación lipoproteinas de baja densidad (LDL) (59). Además, se ha demostrado que la floretina (el aglucón de la florizina) produce relajación endotelial in vitro de aislados de anillos de arterias coronarias, en baño de órganos (60)
Efectos mitocondriales de la florizina
En la década de los 50 del pasado siglo, los estudios sobre el mecanismo de acción de la florizina se centraron en el efecto celular y molecular. Inicialmente, se observó que altas concentraciones de florizina (5 X 10−4 a 10−3 M) producen inhibición del metabolismo aeróbico por reducción de la eficiencia de la fosforilación oxidativa y además induce alteración de la estructura mitocondrial produciendo edema. Ambos fenómenos ocurren también en el curso de los llamados procesos de envejecimiento mitocondrial. Según varios estudios, realizados a lo largo de dicha década, la florizina parece agruparse con otros agentes capaces de iniciar dicho proceso (fostato inorgánico, iones Mn++, 2,4-dinitrofenol, etcétera). Los efectos a nivel mitocondrial parecen comprender además una disminución de la capacidad de concentración de ciertos iones y nucleótidos, el descenso del intercambio fostato-oxígeno, así como la aparición de DPN-asa y de ATPasa magnesio-dependientes (61-65).
Algunos de estos efectos mitocondriales de la florizina se han descrito en relación con su acción en los túbulos renales. Por ejemplo se ha demostrado que las mitocondrias renales de animales tratados de forma crónica con florizina presentan una reducción de la eficiencia de la fosforilación oxidativa. Por otra parte, la presencia de edema turbio en túbulos contorneados renales, en animales tratados con florizina, se ha relacionado con el edema mitocondrial que, en suficiente concentración, puede causar alteración estructural mitocondrial in vivo. Los efectos mitocondriales de la florizina son menos evidentes en presencia de ATP, ADP y malonato, y en las condiciones metabólicas que se producen cuando la florizina alcanza la mitocondria en presencia de ATP y α-cetoglutarato. Se observó que las alteraciones estructurales mitocondriales se relacionan bien con el efecto de estos agentes y con las condiciones en que la florizina induce la inhibición de los fenómenos oxidativos.
En animales de experimentación (perros) se observó que, la infusión continua de florizina en dosis pequeñas (0.6–100 µg/kg/min.), reduce la velocidad máxima de transporte de glucosa (Tm g) en un 20–70%. La florizina se mostraba, pues, como un inhibidor poderoso del transporte de glucosa. Los autores de estos experimentos concluían que, las concentraciones efectivas de florizina en el animal, son del mismo rango que las que alteran el transporte de glucosa y el metabolismo oxidativo in vitro. Sin embargo, el aumento de la tasa de infusión de florizina (incluso hasta 100 µg/Kg/min) no supuso la inhibición completa del transporte de glucosa (66, 67).
La florizina y su herencia
- Identificación de los cotransportadores sodio/glucosa
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| Figura 23. Robert K. Crane (1919-2010). Descubridor del co-transporte sodio-glucosa. |
En la década de 1950, Robert K. Crane (1919-2010) (Figura 23) desempeñó un papel central, en el descubrimiento del mecanismo del transporte de glucosa a la célula, en lo que suponía el primer paso en el metabolismo de la glucosa y su control. Demostró que ni el mecanismo de fosforilación-desfosforilación ni otras reacciones covalentes representaban el transporte de glucosa en el intestino. En agosto de 1960, en Praga, Robert K. Crane presentó por primera vez su descubrimiento del cotransporte de sodio-glucosa como el mecanismo para la absorción intestinal de la glucosa. El Cotransporte fue la primera propuesta de acoplamiento de flujo en biología y fue el evento más importante relacionado con la absorción de carbohidratos en el siglo XX.
Específicamente, Crane propuso que, la acumulación de glucosa en el epitelio intestinal, a través del borde "en cepillo" de la membrana, está acoplada al transporte descendente de Na+ a través de dicho borde "en cepillo". La energía para el transporte activo de glucosa es proporcionada por el gradiente de sodio a través de la membrana celular, con la bomba de Na+/K+ manteniendo el gradiente de sodio. Dicha hipótesis fue pronto probada. ampliada y sus implicaciones fueron aplicadas abarcando un gran número de otras moléculas e iones en la mayoría de las células del organismo.
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Figura 24. Modelo del mecanismo acoplado de co-transporte Na+/Glucosa propuesto por Crane et al.. En el señala a la florizina como inhibidor específico del mismo (Crane RK , Miller D , Bihler I. The restrictions on possible mechanisms of intestinal active transport of sugars. In: Membrane Transport and Metabolism. Proceedings of a Symposium held in Prague, August 22–27, 1960. Edited by A. Kleinzeller and A. Kotyk. Czech Academy of Sciences, Prague, 1961, pp. 439–449) (68). |
Específicamente, Crane propuso que, la acumulación de glucosa en el epitelio intestinal, a través del borde "en cepillo" de la membrana, está acoplada al transporte descendente de Na+ a través de dicho borde "en cepillo". La energía para el transporte activo de glucosa es proporcionada por el gradiente de sodio a través de la membrana celular, con la bomba de Na+/K+ manteniendo el gradiente de sodio. Dicha hipótesis fue pronto probada. ampliada y sus implicaciones fueron aplicadas abarcando un gran número de otras moléculas e iones en la mayoría de las células del organismo.
En la Figura 24 se expone el modelo propuesto por Crane. La glucosa, liberada de la sacarosa de la dieta, es transportada a través de la membrana plasmática por un complejo portador de sodio y glucosa. El transporte de glucosa es impulsado por el gradiente interno de Na+ mantenido por la bomba de Na+. La estrofantidina inhibe la bomba de Na+ eliminando la fuerza impulsora para el transporte cuesta arriba de glucosa. La florizina, un glucósido vegetal, inhibe directamente el cotransporte. Este esquema simple explica el transporte de glucosa a través de la membrana del borde en cepillo intestinal y el requisito de entrada de energía desde la célula. El modelo sigue siendo válido hasta el día de hoy, aunque posteriormente se ha determinado el sitio de inhibición de la florizina que es extracelular, asi como la ubicación de la bomba de Na+/K +, situada en la membrana basolateral. Se acuñó el término symport para definir este tipo de transporte acoplado. También se demostró que el transporte activo de iones y moléculas en plantas y bacterias se debe al symport con protones, como cationes impulsores. Así mismo se identificaron los simportadores de Na+ en bacterias y los simportadores de H+ en mamíferos (68, 69, 70, 71).
La hipótesis del transporte de Na+/glucosa se probó en el intestino y el riñón mediante técnicas in vitro y trazadores radiactivos o ensayos electroquímicos. Se estableció que los azúcares naturales D-glucosa y D-galactosa, y sus homólogos no metabolizados, 3-O-metil-D-glucósido y α-metil-D-glucopiranosido, fueron transportados, a través de la membrana del borde en cepillo, mediante un mecanismo Na+-dependiente, sensible a la florizina. Sin embargo, la florizina tiene escasa o ninguna influencia sobre el mecanismo de transporte de otros azúcares (principalmente las 2-deoxyhexosas) como la 2-deoxy-D-glucosa o la fructosa (la fructosa o levulosa tiene un mecanismo específico de transporte dependiente la proteína GLUT5, codificada por el gen SLC2A5). Todo parece indicar que la falta de un grupo hidroxilo (HO) en la posición del carbono 2 de estos azúcares hace que su transporte no sea totalmente dependiente de Na+, ni sensible a la inhibición por florizina.
El transporte de glucosa se asoció con una despolarización del potencial de membrana, y se observó que la velocidad de transporte dependía del voltaje. Se requirió Na+ en las soluciones extracelulares para conducir el transporte contra gradiente, pero otros iones como H+ y Li+ pueden suplir al Na+, aunque no el K+, Rb+, Cs+ o colina+. La florizina, se mostró como un inhibidor competitivo potente de este mecanismo de transporte (72).
El transporte de glucosa se asoció con una despolarización del potencial de membrana, y se observó que la velocidad de transporte dependía del voltaje. Se requirió Na+ en las soluciones extracelulares para conducir el transporte contra gradiente, pero otros iones como H+ y Li+ pueden suplir al Na+, aunque no el K+, Rb+, Cs+ o colina+. La florizina, se mostró como un inhibidor competitivo potente de este mecanismo de transporte (72).
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| Figura 25. Modelo mecánico de transporte acoplado Na+/azucar propuesto por Schutz (72,73). |
En 1985 se propuso un modelo para el transporte acoplado Na+/glucosa que se basaba en la existencia de una proteína moduladora del mecanismo de symport, situada en la membrana del borde en cepillo. Se modeló como un portador vacío formado por una proteína cargada negativamente y sensible al potencial de membrana. Es un modelo mecánico para el que se proponen seis estados (figura 25), que representarían sendos momentos de orientación a cada lado de la membrana, dependiendo del voltaje de cotransporte de Na+/hexosa, procedente de la electrodifusión de Na+ dentro y fuera del punto de unión. El paso de uno a otro estado representaría etapas de la traslocación o reorientación de la forma cargada del portador, de una superficie a otra (73,74). El proceso por el eque la glucosa ingresa en la célula tendría cuatro etapas: 1) se une al transportador en la cara externa de la membrana; 2) el transportador cambia de conformación y la glucosa y su sitio de unión quedan localizados en la cara interna de la membrana; 3) el transportador libera la glucosa al citoplasma, y 4) el transportador libre del ligando cambia nuevamente de conformación, expone el sitio de unión a la glucosa en la cara externa y retorna a su estado inicial (75).
Al final de la década de los 70 había quedado ampliamente probada la dependencia del ión Na+ del transporte de azucares, a través de las membranas celulares, que se sustancia en un proceso capaz de provocar el paso del azúcar, contra un gradiente de concentración. Dicho proceso se observa principalmente en intestino delgado y en riñón. Pero la identificación de las proteínas, que constituyen los receptores o symporters Na+/Glucosa, tuvo lugar finalmente en la década de los 80 del siglo XX. Dos décadas después de que Robert Crane (68) propusiera la hipótesis del cotransporte Na+/Glucosa.
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Figura 26. Prof. Giorgio Semenza
(1928-2016) catedrático de
Bioquímica del Eidgenössische
Technische Hochschule (ETH) de
Zurich (Suiza).
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- 6-azido-6-deoxiflorizina (azido-Phlz)
- 6-O-[N-(2-nitro-4-azidophenil)-β-alanil]floricina (NAP-β-Ala-Phlz)
- N-(2-nitro-4-azidophenil)-6-amino-6-deoxiflorizina (NAP-N-Phlz)
- N-[N-(2-nitro-4-azidophenil)-β-alanil]-6-amino-6-deoxiflorizinamida (NAP-β-Ala-N-Phlz)
- [2´-O-(β-D-glucopiranosil)-4-azidofloretina, 4-azidoflorizina]
Poco más adelante (1983) (79), investigadores del mismo grupo de Semenza utilizaron anticuerpos monoclonales para marcar e identificar el symport Na+/Glucosa. Los autores reconocen que, las técnicas basadas en el reconocimiento de la proteína co-transportadora, mediante fotoafinidad y marcado diferencial, con análogos de florizina, utilizadas anteriormente, habían tenido un éxito limitado. El anticuerpo monoclonal utilizado (IMl 1) inhibe la absorción de D-glucosa dependiente de Na+ en las vesículas de la membrana del borde en cepillo y la unión de la florizina dependiente de Na+ a estas vesículas y a los fragmentos de membrana extraídos con desoxicolato preparados a partir de ellos.
Según los autores, varias líneas de evidencia sugieren fuertemente que la proteína de 72 kDa, aislada por cromatografía de inmunoafinidad y SDS-PAGE (*), representa (una parte de) el co-transportador de Na + / D-glucosa en el intestino delgado:
La fluoresceina, para el marcado del cotransportador Na+/Glucosa, es otra opción que utilizó el grupo de Wright (Figura 27). Como reactivos usaron lisina fenil-isotiocianato (PITC) y fluoresceína isotiocianato (FITC), para marcar la proteína en ausencia de Na+ y D-glucosa. El marcado específico del transportador se logró pretratando las membranas con PITC en presencia de Na+ y glucosa, lavando y luego marcando con FITC, en presencia o ausencia de Na + y glucosa. La proteína marcada con fluorescencia se identificó luego como una banda de 73 kDa en SDS-PAGE. La presencia de Na+ apagó específicamente la fluorescencia de FITC unida a una lisina, en o cerca del sitio de unión a glucosa, y esto se interpretó como un cambio de conformación que permitía la unión del azúcar (80).
Como el mismo Wright (72) señala, hay pruebas de la existencia de, al menos, dos transportadores diferentes de Na+/Glucosa. Por un lado, estudios de microperfusión en el riñón revelaron que el primer tramo del túbulo proximal absorbe glucosa con un Km (2 mM) más alto que en el tramo mas distal del túbulo proximal (0.5 mM). Por otra parte, se descubrió que las vesículas de membrana con borde en cepillo, preparadas a partir de la corteza externa renal y la médula externa, tienen transportadores de baja (Km 6 mM) y de alta afinidad (Km 0.3 mM) (81,82).
Según los autores, varias líneas de evidencia sugieren fuertemente que la proteína de 72 kDa, aislada por cromatografía de inmunoafinidad y SDS-PAGE (*), representa (una parte de) el co-transportador de Na + / D-glucosa en el intestino delgado:
- Interactúa con un anticuerpo monoclonal dirigido contra este componente de la membrana, como lo demuestra al ser retenido por el inmunoadsorbente preparado a partir de este anticuerpo.
- Se extrae mediante concentraciones moderadas de D-glucosa (10 mM), los valores aparentes de Km y para el transporte de D-glucosa en presencia de Na+ varían entre aproximadamente 0.1 y 2 mM, dependiendo de la configuración experimental.
- Se eluye mediante concentraciones moderadas del conocido inhibidor de este sistema, la florizina (15/µM), los valores aparentes de I y Ki para la unión de la florizina y para inhibición por la florizina del transporte de D-glucosa, en presencia de Na+, varía entre aproximadamente entre 5 y 9 µM.
- No es eluido por D-manosa, un azúcar con una afinidad insignificante de este sistema de transporte.
- En las columnas de inmunoafinidad por florizina o D-glucosa, es la única banda eluída, cuando se utilizan solubilizados de fragmentos de membrana extraídos con desoxicolato por digitonina.
Los autores señalan en este trabajo que, aunque no están en condiciones de asegurar que la proteína aislada sea un todo o una parte de la proteina symport Na+/Glucosa, si está clara la coincidencia de peso molecular con el péptido aislado por técnicas de fotoafinidad. Por otra parte, señalan, que el polipéptido de 72 kDa aislado es al menos parcialmente funcional, ya que interactúa con D-glucosa y con florizina, según lo documentado por estos ligandos (79).
(*) SDS-PAGE es el acrónimo en inglés de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico). Es una técnica ampliamente utilizada en bioquímica, genética, biología molecular y ciencia forense para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética (en función de la longitud de la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros factores).
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| Figura 27. Enerst M. Wright. Professor of Physiology and Mellinkoff Professor of Medicine at the David Geffen School of Medicine at UCLA |
Como el mismo Wright (72) señala, hay pruebas de la existencia de, al menos, dos transportadores diferentes de Na+/Glucosa. Por un lado, estudios de microperfusión en el riñón revelaron que el primer tramo del túbulo proximal absorbe glucosa con un Km (2 mM) más alto que en el tramo mas distal del túbulo proximal (0.5 mM). Por otra parte, se descubrió que las vesículas de membrana con borde en cepillo, preparadas a partir de la corteza externa renal y la médula externa, tienen transportadores de baja (Km 6 mM) y de alta afinidad (Km 0.3 mM) (81,82).
El transportador SGLT de baja afinidad tenía una aparente estequiometría (*) de acoplamiento de 1 Na: 1 azúcar, mientras que para el transportador de alta afinidad, era 2 Na: 1 azúcar. El transportador de baja afinidad se denominó SGLT2, y el transportador de alta afinidad SGLT1 (83). Además, diferentes defectos hereditarios del transporte de glucosa en el intestino, como la malabsorción intestinal de glucosa/galactosa, no se asocia a un defecto importante en la reabsorción renal de glucosa, y los defectos congénitos en la reabsorción renal (como glucosuria renal familiar) no se acompañan por defectos en la absorción intestinal (72).
(*) Estequiometría (del griego στοιχειον, stoikheion, 'elemento' y μετρον, métrón, 'medida') es el cálculo de las relaciones cuantitativas entre los reactivos y productos en el transcurso de una reacción química.
- Clonación de cotransportadores sodio/glucosa
Después de la identificación y diferenciación de los dos tipos symport Na+/Glucosa (SGLT1, a nivel intestinal y renal, y SGLT2, a nivel renal) solo quedaba pendiente una tarea que, hasta la década final del pasado siglo, no se pudo completar: la clonación de las proteínas de los co-transportadores.El grupo de Wright clonó los dos principales cotransportadores de Na+/glucosa SGLT1 (82) y SGLT2 (84, 85) e hicieron gran parte de la caracterización in vitro de los mismos, demostrando que SGLT1 tiene una mayor afinidad por la glucosa que SGLT2 (Km por glucosa ∼0.4 mmol/L y 2 mmol/L, respectivamente), mientras que SGLT2 tiene una mayor capacidad (72). SGLT1 se expresa a niveles altos en el intestino y también en el riñón, corazón y músculo esquelético, mientras que SGLT2 se expresa casi exclusivamente en el riñón (72).
Se utilizó electroforesis en gel para fraccionar ARNm, y aislar una fracción enriquecida (2.0–2.6 kb) que contenía el ARNm que codifica SGLT1m (86). Apartir de esta fracción se sintetizó cADN. Se preparó ARN sintético a partir de cADN enn agrupaciones de clones y se usó para seleccionar la actividad de transporte en el ensayo de expresión. Un grupo de clones dio una señal positiva, y este grupo se subdividió aún más hasta que se aisló un solo clon: pMJC424, seleccionado que aumentó el Na+dependiente de la absorción de α-d-glucopiranosido (αMDG) en más de 1,000 veces (85). Se utilizaron ovocitos de Xenopus laevis como sistema de expresión. Poco después, se clonó SGLT1 humano (86).
La clonación y secuenciación co-transportador de Na+/glucosa (SGLTI) del intestino humano y la comparación de su estructura con otros transportadores clonados ha puesto de manifiesto interesantes homologías. A nivel de ADN y de aminoácidos y niveles de estructura secundaria, existe una estrecha y evidente homología entre los co-transportadores de Na+/glucosa intestinales humano y del conejo. Pero, además se ha detectado una significativa homología también entre estos y el co-transportador Na+/prolina de Escherichia coli. Sin que se haya detectado una homología similar detectable con otras proteínas conocidas. De ello se dedujo que los co-transportadores nativos de glucosa de los mamíferos y de procariotas (Na+/prolina) comparten un gen ancestral común (87).
Se utilizó electroforesis en gel para fraccionar ARNm, y aislar una fracción enriquecida (2.0–2.6 kb) que contenía el ARNm que codifica SGLT1m (86). Apartir de esta fracción se sintetizó cADN. Se preparó ARN sintético a partir de cADN enn agrupaciones de clones y se usó para seleccionar la actividad de transporte en el ensayo de expresión. Un grupo de clones dio una señal positiva, y este grupo se subdividió aún más hasta que se aisló un solo clon: pMJC424, seleccionado que aumentó el Na+dependiente de la absorción de α-d-glucopiranosido (αMDG) en más de 1,000 veces (85). Se utilizaron ovocitos de Xenopus laevis como sistema de expresión. Poco después, se clonó SGLT1 humano (86).
La clonación y secuenciación co-transportador de Na+/glucosa (SGLTI) del intestino humano y la comparación de su estructura con otros transportadores clonados ha puesto de manifiesto interesantes homologías. A nivel de ADN y de aminoácidos y niveles de estructura secundaria, existe una estrecha y evidente homología entre los co-transportadores de Na+/glucosa intestinales humano y del conejo. Pero, además se ha detectado una significativa homología también entre estos y el co-transportador Na+/prolina de Escherichia coli. Sin que se haya detectado una homología similar detectable con otras proteínas conocidas. De ello se dedujo que los co-transportadores nativos de glucosa de los mamíferos y de procariotas (Na+/prolina) comparten un gen ancestral común (87).
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Figura 28. Modelo propuesto de orientación de la membrana del cotransportador de Na+/glucosa intestinal humano. (Hediger M A, Turk E, Wright EM. Homology of the human intestinal Na+/glucose and Escherichia coli Na+/proline cotransporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989; 86(15): 5748–5752) (87). |
SGLT1 constituye una familia de proteínas de transporte de membrana dependientes de Na+ que comprende homólogos eucariotas y bacterianos. A su vez esta familia pertenece a una superfamilia de familias, no homólogas, que comparten, como función general común, el transporte de solutos, como sustrato, acoplado con sodio y una estructura común de 12 tramos de membrana (figura 28) (87).
El symport (cotransportador) de sodio/sustrato es un mecanismo generalizado de transporte de solutos a través de las membranas citoplasmáticas de las células pro y eucariotas. El sistema utiliza la energía almacenada, en un gradiente electroquímico de sodio dirigido hacia el interior de la célula, para impulsar el paso de solutos contra un gradiente de concentración. La energía se obtiene mediante bombas primarias de sodio, como ATPasas Na+/K+, o mediante la acción de los antiportadores de Na+/H+. Los transportadores de Na/sustrato se agrupan en diferentes familias según las similitudes de secuencia de nucleótido. Existen familias mixtas de transportadores cuyos miembros difieren en la elección del ión de acoplamiento o catalizan procesos de simportación o antipuerto. Además, en transportadores individuales, la elección del ión de acoplamiento puede verse influenciada por la naturaleza del sustrato (88).
La superfamilia de los symports Na+/sustrato tiene más de cien miembros tanto en procariotas como eucariotas (Figura 29). Común a las proteínas de esta familia es el hecho de que todas utilizan la fuerza motriz de sodio para conducir el transporte contra gradiente de variados sustratos, entre los que se cuentan azúcares, aminoácidos, vitaminas, iones, urea, agua y otros.
El symport (cotransportador) de sodio/sustrato es un mecanismo generalizado de transporte de solutos a través de las membranas citoplasmáticas de las células pro y eucariotas. El sistema utiliza la energía almacenada, en un gradiente electroquímico de sodio dirigido hacia el interior de la célula, para impulsar el paso de solutos contra un gradiente de concentración. La energía se obtiene mediante bombas primarias de sodio, como ATPasas Na+/K+, o mediante la acción de los antiportadores de Na+/H+. Los transportadores de Na/sustrato se agrupan en diferentes familias según las similitudes de secuencia de nucleótido. Existen familias mixtas de transportadores cuyos miembros difieren en la elección del ión de acoplamiento o catalizan procesos de simportación o antipuerto. Además, en transportadores individuales, la elección del ión de acoplamiento puede verse influenciada por la naturaleza del sustrato (88).
La superfamilia de los symports Na+/sustrato tiene más de cien miembros tanto en procariotas como eucariotas (Figura 29). Común a las proteínas de esta familia es el hecho de que todas utilizan la fuerza motriz de sodio para conducir el transporte contra gradiente de variados sustratos, entre los que se cuentan azúcares, aminoácidos, vitaminas, iones, urea, agua y otros.
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| Figura 29. Árbol filogenético de miembros de la superfamilia de symports Na/soluto. Las relaciones filogenéticas se analizaron con el algoritmo de alineación de secuencia múltiple CLUSTAL W. Claves de colores: Rojo, transportadores de sodio/prolina; verde, transportadores de sodio/azúcar; azul, transportadores de sodio/pantotenato; amarillo, dominios sensores de supuestas quinasas sensoras (Jung, H. The sodium/substrate symporter family: structural and functional features. FEBS Letters 2002; 529(1):73-77) (88). |
Entre los miembros mejor caracterizados del SSSF se encuentran el transportador humano de Na+/ glucosa (SGLT1), que cataliza la absorción con una estequiometría sodio/sustrato 2:1. SGLT1 combina la absorción de dos sodio y una molecula de glucosa con el transporte de 264 moléculas de agua. En la isoforma SGLT1 de conejo (rSGLT1), el sodio puede ser sustituido por protones o iones de litio mediante el cual la aparente afinidad de azúcar (aparente Km (azúcar)) disminuye en dos órdenes de magnitud (de 0.2 a 30 mM) (88).
Los homólogos del cotransportador de Na +/glucosa, la familia SGLT, incluyen secuencias de origen mamífero, eubacteriano, levadura, insecto y nematodo. Los sustratos cotransportados son azúcares, inositol, prolina, pantotenato, yoduro, urea y solutos indeterminados. Los miembros de la familia SGLT comparten una topología similar o idéntica de los elementos que abarcan la membrana, en virtud de su ascendencia común y el acoplamiento similar del transporte de solutos al flujo descendente de sodio (89).
Originalmente se propuso para SGLT1 una estructura con 11 dominios transmembrana. Sin embargo, los dominios propuestos posteriormente han modificado los primeros modelos de engarce de la proteína en la membrana celular. En el caso de la SGLT1 humana, el grupo de Wright, utilizando métodos de mutagenesis de escaneo de N-glucosilación (*). Este método se ha utilizado para el mapeo de varias proteínas de membrana, entre ellas la GLUT 1, proteína facilitadora de transporte de glucosa.
(*) La N-glucosilación de las proteínas de la membrana eucariota es un evento co-traduccional que ocurre en la luz del retículo endoplásmico (ER). Este proceso es catalizado por un complejo de oligosacaril transferasa (OST), asociado a la membrana, que transfiere un oligosacárido preformado (Glc (3) Man (9) GlcNAc (2) -) a un receptor de cadena lateral de asparagina (Asn) ubicado dentro del sequon (-Asn-X-Ser/Thr-) (sequon es una secuencia de aminoçácidos consecutivos en una proteína, que puede servir como punto de unión de un polisacárido, con frecuencia un glicano N-ligando, que se une a la la proteína a través del átomo de nitrógeno en la cadena lateral de la asparagina (Asn)) Los experimentos de exploración de mutagénesis de N-glucosilación, en los que se introducen nuevos sitios aceptores en sitios únicos dentro de las proteínas de membrana, han demostrado que los sitios aceptores deben ubicarse a una distancia mínima (12-14 aminoácidos) de la superficie de la membrana luminal del ER para poder estar eficientemente N-glicosilado. La mutagénesis por escaneo de la N-glucosilación puede usarse para determinar la topología de la proteína de membrana y también como una regla molecular para definir los extremos de los segmentos transmembrana (90).En principio se propusieron 11 dominios transmembrana para la proteína SGLT1, pero estudios posteriores, basados en análisis funcionales, han llevado al establecimiento de un modelo para SGLT1 que incorpora 14 dominios. En este modelo el extremo N-ligando se proyecta extracelularmente, mientras que el dominio C-terminal es citoplasmático. Este modelo se evaluó mediante algoritmos avanzados (PredictProtein y MEMSAT) que se basaron en datos empíricos predictivos de hélices transmembrana. Varias consideraciones sugirieron que el C-terminal hidrofóbico forma una 14ª hélice transmembrana (Figura 30), que diferencia los miembros eucarióticos de la familia SGLT1 de los homólogos bacterianos (91).
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Figura 30. Modelo de estructura secundaria de SGLT1 humano, con 14 dominios transmembrana, determinado por escaneo mutante de N- glucosilación, y predicciones de incorporación de los extremos de la hélice transmembrana (91). |
- Genes SLC5: humanos
Los solutos transportados por los miembros del grupo SLC son muy diversos, incluyendo moléculas orgánicas cargadas y no cargadas, iones inorgánicos y amoníaco.
Originalmente propuesta por el HUGO (Human Genome Organisation) Gene Nomenclature Committee (HGNC), la nomenclatura de los genes SLC, sirve para denominar los genes que codifican los diferentes transportadores de solutos. En cualquier caso, existen varias clasificaciones de transportadores de membrana y ello puede constituir un problema para los investigadores por las posibles redundancias. En este sentido, una clasificación más general de los transportadores transmembrana se encuentra en la Transporter Classification Database (TCDB; http://www.tcdb.org), que sirve como punto de referencia común en la investigación de proteínas de transporte. Esta base de datos contiene más de 10.000 proteínas no redundantes, que representan a todas las familias de los sistemas de transporte transmembrana conocidas hasta la actualidad (93).
La familia SGLT aumentó con la identificación del cotransportador de Na+/glucosa renal (SGLT2) (94), hasta un total de 12 symports, que constituyen los representantes humanos de esta familia de proteínas. En la figura Figura 31 aparecen representados, en un árbol filogenético sin raices, todos los miembros humanos de los genes SLC5 (72, 95)
Dos familias de genes son responsables de la absorción de glucosa a través del intestino delgado, la reabsorción de glucosa del filtrado glomerular, la captación cerebral a través de la barrera hematoencefálica y la captación y liberación de glucosa de todas las células del cuerpo. Estos son los transportadores de glucosa facilitados, familia de genes GLUT o SLC2, y los cotransportadores de glucosa acoplados a sodio, la familia de genes SGLT o SLC5. Los GLUT son responsables del transporte pasivo y descendente de glucosa a través de las membranas celulares, es decir, estos transportadores aceleran o facilitan el equilibrio del azúcar a través de una membrana. Los mejores ejemplos incluyen GLUT1 involucrado en el transporte de glucosa a través de las células endoteliales de la barrera hematoencefálica y GLUT4 responsable de la captación de glucosa estimulada por insulina en el músculo esquelético. En el caso de los SGLT, el miembro más conocido es SGLT1, que es responsable del transporte "activo" de glucosa a través de la membrana del borde en cepillo del intestino delgado (96).
(*) Northern blot, hibridación northern o ensayo northern es una técnica de detección de moléculas de ARN, de una secuencia dada, dentro de una mezcla compleja (ejemplo, un ARN mensajero para un péptido dado en una muestra de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos de acuerdo con su tamaño. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la que se efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.El nombre de la técnica deriva de la que detecta ADN, denominada Southern blot en honor a su inventor, Edwin Southern (1975). En 1977, James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford desarrollaron el northern blot y lo denominaron empleando el punto cardinal opuesto («northern», septentrional en inglés, frente al meridional «southern»).
Los SLC contienen una estructura típica de las proteínas de membrana, con varias hélices alfa transmembrana hidrófobas, conectadas entre sí por bucles intra y extracelulares hidrófilos. Dependiendo de la SLC, estos transportadores son funcionales como monómeros u homo o heterooligómeros obligados. Muchas familias de SLC son miembros de la superfamilia de facilitadores principales (MFS)(*), entre los que se encuentran los transportador de glucosa 1 (GLUT1) y 2 (GLUT2).
(*) A la superfamilia de facilitadores principales (MFS) pertenecen un grupo de proteínas de transporte de membrana, que facilitan el movimiento de pequeños solutos a través de las membranas celulares en respuesta a gradientes quimiosmóticos. En el caso de GLUT1 y GLUT2, ambos facilitan, en diferentes contextos tisulares, el transporte de glucosa a través de las membranas plasmáticas celulares de mamíferos.
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| Figura 31. Arbol filogenético de los miembros humanos de la familia de genes SLC5. El SGLT6 también se conoce como SMIT2 (Na+/inositol cotransportador 2). SMIT, mioinositol sódico; CHT, colina; SMVT, sodio multivitamina; SMCT, ácido monocarboxílico de sodio; NIS, sodio cotransportadores de yoduro (95) (Wright EM, Turk E.The sodium glucose cotransport family SLC5Pflügers Arch 2004; 447(5):510–518) . |
Se han identificado 11 genes humanos (Figura 31) (la familia de cotransportadores de Na+/glucosa (SLCA5) tiene 220 o más miembros en células animales y bacterianas), expresados en numerosos tejidos (desde los epitelios al sistema nervioso central (Figura 32). La función de nueve de ellos ha sido puestas de manifiesto mediante estudios basados en sistemas de expresión heterólogos. Seis de ellos son cotransportadores del tipo Na+/sustrato (Tabla de la figura 33), acoplados para diversos solutos. Incluyen proteínas que transportan azúcares (SLC5A1, 2, 9 y 11), mioinositoles (SLC5A3 y 11), aniones (SLC5A5 y SLC5A8), vitaminas (SLC5A6) y colina (SLC5A7), un huérfano (SLC5A10) y un sensor de glucosa (SLC5A4, un canal de iones activado por glucosa). Las mutaciones en tres genes producen enfermedades genéticas (malabsorción de glucosa-galactosa, glucosuria renal e hipotiroidismo). Los miembros de esta familia son proteínas de membrana multifuncionales en el sentido de que también se comportan como uniportadores, canales de urea y agua, y cotransportadores de urea y agua.
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Figura 32. Expresión de ARNm de SGLT2 en muestras de tejido humano. La máxima expresion de receptores SGLT2 es en la corteza renal (Wright E M, Loo D F, Hirayama B A. Biology of Human Sodium Glucose Transporters. Physiol Rev 2011; 91:733–794)(72). |
SGLT1 se expresa de forma destacada en el intestino delgado, pero el gen también se transcribe en el túbulo proximal renal y otros órganos como el cerebro y el corazón. Los sustratos naturales son glucosa y galactosa con afinidades aparentes (K0.5) de 0,5 m m . Mutaciones en el gen SGLT1 causan malabsorción de glucosa y galactosa (ver más abajo). El SGLT2 también se expresa en varios tejidos de todo el cuerpo, incluido el túbulo proximal renal, donde desempeña un papel importante en la reabsorción de glucosa del filtrado glomerular. Funcionalmente, este transportador se diferencia del SGLT1 en que tiene una menor afinidad por la glucosa y no transporta galactosa. Los transportadores que favorecen a otros sustratos también pueden ser importantes en el metabolismo de la glucosa. SGLT4 parece ser un transportador de baja afinidad por manosa y glucosa y el gen se expresa en una variedad de tejidos, incluido el páncreas. SGLT5 es una proteína con función desconocida que se expresa casi exclusivamente en la corteza renal. Aunque SGLT6 (SMIT2) es un transportador de mioinositol de alta afinidad, también se comporta como un transportador de glucosa de baja afinidad. Dadas las concentraciones plasmáticas normales de mioinositol y glucosa y el hallazgo de que ambos sustratos tienen la misma velocidad máxima de transporte, está claro que el SGLT6 debería desempeñar un papel significativo en la captación de glucosa en las células del cerebro, riñón e intestino donde este gen es expresado. Por otra parte, SGLT3, que se expresa en el sistema nervioso entérico y en la unión neuromuscular, no es un transportador sino que se comporta como un sensor de glucosa.
Figura 33. Genes SLC5 responsables del cotransporte de Na/glucosa, junto con sus sustratos, afinidades aparentes y perfiles de expresión.
Hoy sabemos que el principal mecanismo de reabsorción para la D-glucosa en el riñón se debe a un cotransportador de Na+/glucosa de baja afinidad y alta capacidad, que se encuentra en el segmento de túbulo contorneado proximal temprano S1, y que tiene una estequimetría Na+/glucosa de 1:1 . En 1994 el grupo de Hediger, del Departamento de Medicina del Brigham and Women's Hospital de Boston (97), aportan las primeras evidencias moleculares de este mecanismo reabsorbente de D-glucosa renal. Los autores de este importante trabajo comunican la caracterización de un ADNc de riñón humano, previamente clonado, que codifica una proteína con una identidad del 59% para el cotransportador de Na+/ glucosa de alta afinidad (SGLT1). A diferencia de SGLT1, SGLT2 no transporta D-galactosa.
Utilizando hibridación in situ combinada e inmunocitoquímica, con anticuerpos marcadores específicos del segmento del túbulo (Figura 34), los autores demostraron un nivel extremadamente alto de mensaje SGLT2 en los segmentos S1 del túbulo proximal. Este nivel de expresión también fue evidente en las transferencias Northern (*) y probablemente confiere la alta capacidad de este sistema de transporte de glucosa. Concluyen que SGLT2 tiene propiedades características de cotransportador de Na+/glucosa renal de baja afinidad y alta capacidad (97).
Utilizando hibridación in situ combinada e inmunocitoquímica, con anticuerpos marcadores específicos del segmento del túbulo (Figura 34), los autores demostraron un nivel extremadamente alto de mensaje SGLT2 en los segmentos S1 del túbulo proximal. Este nivel de expresión también fue evidente en las transferencias Northern (*) y probablemente confiere la alta capacidad de este sistema de transporte de glucosa. Concluyen que SGLT2 tiene propiedades características de cotransportador de Na+/glucosa renal de baja afinidad y alta capacidad (97).
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Figura 34. Localización de la señal de SGLT2 en túbulos renales por hibridación in situ (97). |
La florizina resultó ser también una buena herramienta en el estudio de las características biofísicas de los dos tipos de cotransportadores de Na+/glucosa. En un estudio del grupo de Wright (98) utilizaron α-metil-D-glucopiranosido (αMG) (un análogo de la glucosa no metabolizable) para estudiar las propiedades cinéticas de las corrientes evocadas por este azúcar, en función de las concentraciones externas del mismo y de Na+. Ello puso de manifiesto la existencia de un modelo de transporte simultáneo, con un orden según el cual el Na+ se une primero y dicha unión es dependiente del voltaje. La florizina se mostró como un inhibidor potente de las corrientes evocadas por el azúcar y bloqueó la corriente interna de Na+ en ausencia del mismo. En este estudio, las diferencias entre SGLT1 y SGLT2 fueron:
- La constante de afinidad aparente ( K 0.5) para αMG (≈3 mM) fue un orden de magnitud mayor para SGLT2;
- SGLT2 excluyó galactosa, lo que sugiere una unión discreta de este azúcar y por tanto una mayor especificidad por glucosa.
- K 0.5 para Na + fue menor en SGLT2, lo que indica una menor eficacia de flujo
- El coeficiente de Hill (*) para Na+ fue 1 para SGLT2 y de 2 para SGLT1.
(*) El coeficiente de Hill (n) indica cuántas de las zonas de unión de sustrato de una enzima afectan a la afinidad de la unión del sustrato en el resto de las zonas de unión o la expresión numérica de la fracción de una macromolécula saturada por un ligando. Ello estima el grado de cooperación en el proceso vinculante. Puede tomar valores mayores o menores que 1: n < 1: indica cooperatividad negativa. n > 1: indica cooperatividad positiva.El modelo cinético de seis estados (Figura 35), previamente propuesto para SGLT1, es igualmente aplicable a SGLT2, con una reducción de acoplamiento de Na+/glucosa de 2 a 1. La conclusión del estudio de Wright es que el comportamiento cinético de SGLT2 es muy similar al de SGLT1 y ello sugiere un mecanismo común, pero con una estequiometría de acoplamiento de Na+/glucosa diferente: 2: 1 (para SGLT1) frente a 1: 1 (para SGLT2). La reducción general de la afinidad aparente por el azúcar y la exclusión efectiva de galactosa sugiere que la arquitectura molecular del sitio de unión al azúcar en SGLT2 es bastante distinta de la de SGLT1 (98).
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| Figura 35. Modelo cinético de seis estados que describe el funcionamiento del cotransportador de Na + / glucosa pSGLT2. Modelo cinético de seis estados en el que el portador vacío está cargado negativamente (la valencia aparente de la carga móvil es -1) y el coeficiente de acoplamiento de Na + es 1 (98). |
En humanos los riñones filtran diariamente unos 180 gramos de D-glucosa. En condiciones normales esta glucosa se reabsorbe en los túbulos proximales. El mecanismo de reabsorción es bien conocido, a través del borde "en cepillo" de la membrana de las células del túbulo renal, hacia el interior celular, y posteriormente la difusión facilitada, a través de la membrana basolateral, hacia la sangre (Ver mas adelante en Figura 38).
La mayor tasa de reabsorción de glucosa tiene lugar en el túbulo contorneado proximal por un symport de baja afinidad y alta capacidad (SGLT2). El resto de la glucosa se reabsorbe en el túbulo recto proximal mediante un symport de alta afinidad y baja capacidad (SGLT1).
Se han identificado al menos tres proteínas candidatas como co-transportadoras renales en humanos: SGLT1, SGLT2 y SGLT3.
Los estudios genéticos han puesto de manifiesto que hay dos genes diferentes que regulan la expresión de sendas proteínas responsables del co-transporte a través del borde "en cepillo".
Los genes que codifican SGLT1 de alta afinidad y el SGLT2 de baja afinidad están ubicados en diferentes cromosomas: SGLT1 reside en el cromosoma 22q 13.1 (99) y SGLT2 se encuentra en el cromosoma 16 cerca del centrómero (100). Un defecto del gen SGLT2 es responsable de la reabsorción de glucosa alterada en pacientes con glucosuria renal (97). En roedores con hiperglucemia, se ha demostrado un aumento de la expresión renal de SGLT2 (101,102). Este aumento de expresión de SGLT2 se ha observado también en humanos con DM2 (103). En cuanto a la expresión de SGLT1, a nivel intestinal, está regulada por la dieta y otros factores (104) y aumenta en sujetos con DM2 (105).
La mayor tasa de reabsorción de glucosa tiene lugar en el túbulo contorneado proximal por un symport de baja afinidad y alta capacidad (SGLT2). El resto de la glucosa se reabsorbe en el túbulo recto proximal mediante un symport de alta afinidad y baja capacidad (SGLT1).
Se han identificado al menos tres proteínas candidatas como co-transportadoras renales en humanos: SGLT1, SGLT2 y SGLT3.
Los estudios genéticos han puesto de manifiesto que hay dos genes diferentes que regulan la expresión de sendas proteínas responsables del co-transporte a través del borde "en cepillo".
Los genes que codifican SGLT1 de alta afinidad y el SGLT2 de baja afinidad están ubicados en diferentes cromosomas: SGLT1 reside en el cromosoma 22q 13.1 (99) y SGLT2 se encuentra en el cromosoma 16 cerca del centrómero (100). Un defecto del gen SGLT2 es responsable de la reabsorción de glucosa alterada en pacientes con glucosuria renal (97). En roedores con hiperglucemia, se ha demostrado un aumento de la expresión renal de SGLT2 (101,102). Este aumento de expresión de SGLT2 se ha observado también en humanos con DM2 (103). En cuanto a la expresión de SGLT1, a nivel intestinal, está regulada por la dieta y otros factores (104) y aumenta en sujetos con DM2 (105).
Por otra parte, en pacientes con DM2, las células tubulares renales proximales humanas tienen niveles marcadamente incrementados de mRNA y proteína SGLT2 y un incremento de 4 veces en la captura de α-metil-D-glucopiranosido (AMG), un análogo de la glucosa no metabolizable. Desde el punto de vista fisiopatológico, en relación con la progresión de la nefropatía diabética, un aumento de la reabsorción proximal de Na+/glucosa, en pacientes diabéticos, implicaría un aumento de volumen de las células tubulares y de la tasa de filtrado glomerular (106). Ello, a su vez, representaría, al menos en parte, una fase precoz de la nefropatía diabética (107). Otra hipótesis sobre el desarrollo de la nefropatía en pacientes con DM señala que el aumento de la reabsorción de glucosa, en pacientes diabéticos acelera la glucosilación irreversible de proteínas tisulares (108).
- De la florizina a los iSGLT
Han pasado 185 años desde el descubrimiento de la florizina. Actualmente es generalizado el tratamiento de la DM2 con fármacos glucosúricos, con estructuras químicas basadas en aquella. Durante casi dos siglos se han ido desgranando las propiedades de la florizina, que ha estado presente en la historia de la medicina, especialmente en los campos de investigación de la Endocrinología y de la Nefrología. Como hemos visto, a lo largo de este artículo, se trata de una historia fascinante en la que, la participación de numerosos investigadores, médicos y bioquímicos, ha llevado a desentrañar una parte importante de la fisiología humana, que atañe a la absorción, metabolismo y excreción de los hidratos de carbono.
La florizina es un inhibidor de los cotransportadores de Na+/glucosa (SGLT), presente, sobre todo, en la corteza y, en menor proporción, en otras partes del manzano, como los brotes y hojas verdes y el propio fruto del árbol. Al no tratarse de un inhibidor selectivo, de SGLT1 o SGLT2, su efecto básico es la inhibición de la absorción de glucosa, a nivel intestinal, y de la reabsorción de la glucosa filtrada, a nivel renal. Como consecuencia de la inhibición de la reabsorción se produce un aumento de la excreción renal de glucosa, que puede llegar a la inhibición completa de la reabsorción (33).
La florizina es un inhibidor de los cotransportadores de Na+/glucosa (SGLT), presente, sobre todo, en la corteza y, en menor proporción, en otras partes del manzano, como los brotes y hojas verdes y el propio fruto del árbol. Al no tratarse de un inhibidor selectivo, de SGLT1 o SGLT2, su efecto básico es la inhibición de la absorción de glucosa, a nivel intestinal, y de la reabsorción de la glucosa filtrada, a nivel renal. Como consecuencia de la inhibición de la reabsorción se produce un aumento de la excreción renal de glucosa, que puede llegar a la inhibición completa de la reabsorción (33).
Es sabido desde los años 30 del pasado siglo que, la práctica totalidad de la glucosa filtrada en el glomérulo, es reabsorbida en los túbulos renales, según una tasa máxima de reabsorción, y siempre que las concentración de glucosa plasmática permanezca por debajo de un valor umbral (umbral renal de la glucosa o RTG). Por encima del RTG, la excreción urinaria de glucosa (EUG), aumenta de forma casi lineal a la glucosa plasmática.
En 1987, Rossetti et al. (del grupo de De Fronzo) demostraron que la hiperglucemia podría estar implicada en el desarrollo de resistencia a la insulina. La sensibilidad a la insulina se evaluó con la técnica de pinza hiperinsulinémica en ratas. El metabolismo de la glucosa mediado por insulina se redujo en aproximadamente un 30% (p< 0,001) en ratas diabéticas. El tratamiento con florizina en ratas diabéticas normalizó completamente la sensibilidad a la insulina, pero no tuvo ningún efecto sobre la acción de la insulina en los controles. La interrupción del tratamiento, en ratas diabéticas tratadas con florizina, tuvo como consecuencia la reaparición de resistencia a la insulina (109,110).
Sabemos pues, que la florizina es un potente inhibidor de los dos tipos de symport SGLT conocidos mas importantes en el transporte de glucosa: el SGLT-1 intestinal responsable de la absorción de glucosa del intestino delgado y el SGLT-2 y SGLT-1, ambos responsables de la reabsorción de glucosa en el riñón. Sin embargo, la florizina tiene algunas desventajas para su uso en la terapia de la diabetes. La florizina no tiene selectividad ya que inhibe ambos SGLT, con baja selectividad terapéutica; se absorbe mal en el intestino delgado y se hidroliza eficazmente por la lactasa intestinal (LPH = lactosa-florizina-hidrolasa) dando como resultado una baja biodisponibilidad oral. Por otra parte, el producto de la hidrólisis de florizina, como ya hemos señalado antes, es la aglicona floretina, que es un inhibidor del transportador de glucosa ubicuo GLUT1, bloqueando la captación de glucosa en varios tejidos (72).
A pesar de las desventajas citadas, la florizina es la base principal para el desarrollo de análogos sintéticos con biodisponibilidad, estabilidad y selectividad mejoradas para SGLT. Ello ha hecho de nuevo despertar el interés por la investigación sobre el uso de la florizina, incluyendo la de los productos alimenticios que pueden aportarla, y de su utilidad en el tratamiento adicional de la diabetes y la obesidad. En la Figura 36 se puede observar una representación histórica de la evolución del conocimiento sobre la florizina, desde la década de los 30 del siglo XIX a la actualidad y del desarrollo de los fármacos antidiabéticos inhibidores SGLT (111).
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| Figura 36. Linea temporal de algunos de los avances clave sobre el transporte de glucosa por SGLT en membranas y el desarrollo de inhibidores de SGLT (Mudaliar S., Polidori D, Zambrowicz B, Henry RR. Sodium-Glucose Cotransporter Inhibitors: Effects on Renal and Intestinal Glucose Transport: From Bench to Bedside. Diabetes Care 2015; 38: 2344-2353) (111) |
La síntesis de análogos de florizina fue el comienzo de una nueva clase de fármacos antidiabéticos glucosúricos: las glifozinas. En el desarrollo de esta clase de fármacos, los primeros en sintetizarse fueron los O-glucosidos de florizina. Concretamente, los fármacos sintéticos derivados de la florizina, T-1095 y T-1095A fueron los primeros iSGLT2 (inhibidores de los symport SGLT2) disponibles para su uso por vía oral. A diferencia de la florizina, T-1095 se absorbe por vía oral y pasa a la circulación. Se metaboliza a su forma activa T-1095A y suprime la actividad SGLT2 renales. Con una mejor selectividad para SGLT-2 (IC 50 de 200 nM contra SGLT1 y 50 nM contra SGLT2). Se demostró que, administrado por vía oral aumenta la excreción urinaria de glucosa en animales diabéticos, disminuyendo los niveles de glucosa en sangre y suprimía la hiperglucemia posprandial después de una carga de comida en ratas con diabetes inducida por estreptozotocina (STZ). El tratamiento a largo plazo con T-1095, redujo tanto la glucosa en sangre, como los niveles de HbA1c, en ratas con diabetes inducida por STZ y en ratones KK amarillos (*). Además, hubo una mejoría del metabolismo anormal de carbohidratos, de la hiperinsulinemia e hipertrigliceridemia, y del desarrollo de microalbuminuria, en ratones KK (112).
(*) El ratón de la cepa KK es uno de los modelos poligénicos más adecuados como análogos de la DM2 con obesidad moderada. La cepa original se obtuvo en Japón, mediante cruces seleccionando los individuos con mayor peso. De modo característico, estos ratones adquieren obesidad gradual cuando se hacen adultos, además de resistencia a la insulina, hiperinsulinemia compensadora e hiperplasia de células insulares, apareciendo finalmente una discreta hiperglicemia (113).
Mas tarde se desarrollaron otros análogos de O-glucósidos: como la sergliflozina (114) y la remogliflozina (115). Sin embargo, todos estos primeros análogos sintéticos de florizina tenían el inconveniente de sus escasa estabilidad desde el punto de vista farmacocinético, así como de una insuficiente selectividad SLGT2.
A principios de este siglo se desarrolló un método para la síntesis de análogos de C-glucosidos de la florizina utilizando una variante del protocolo de acoplamiento de la reacción de Suzuki (*) (116).
(*) La reacción de Suzuki es una reacción orgánica de acoplamiento cruzado, donde los grupos de acoplamiento son un ácido borónico y un organohaluro catalizado por un complejo de paladio. Tambien denominada ortometalación dirigida (DoM), desde su divulgación, la combinación de DoM y el acoplamiento cruzado catalizado por metales de transición se ha convertido en una estrategia común en síntesis y ha encontrado un uso generalizado en la preparación de compuestos aromáticos y heteroaromáticos biológicamente interesantes. Se han introducido una variedad de grupos funcionales utilizando DoM, seguido de diferentes reacciones de acoplamiento cruzado para formar carbono-carbono, carbono-oxígeno, carbono-enlaces nitrógeno y carbono-azufre para preparar moléculas de interés sintético y biológico (117)
En 2008, tuvo lugar el descubrimiento de la dapagliflozina, un análogo del glucósido C de la florizina, con alta selectividad para SGLT2 (118), que fue aprobada para el tratamiento de la DM2 en Europa en 2012 y en los EE. UU. en 2014. Investigaciones clinicas y farmacológicas muy intensas en el ámbito del tratamiento de la DM2, con los glucosúricos derivados de la florizina, llevaron poco después al desarrollo, aprobación y comercialización de otros análogos del glucósido C de la florizina, con una alta selectividad SGLT2, como la canagliflozina (119) y empagliflozina (120).
En Japón se han aprobado otras gliflozinas, como la ipragliflozina, la luseogliflozina y la tofogliflozina (111). Se siguen investigando nuevas glifozinas y una de las últimas en comercializarse es la ertuglifocina, un fármaco resultado de la colaboración de Merck y Pfizer, y aprobado por la FDA como monoterapia y en combinación con sitagliptina o metformina en diciembre de 2017 (121).
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| Figura 37. Moléculas de las glifozinas desarrolladas a partir de la florizina. |
Las gliflozinas se administran por vía oral y se absorben bien en el intestino delgado. Para dapagliflozina, la inhibición de SGLT2 frente a SGLT1 es 1200 veces mayor (SGLT2: IC 50 = 1,2 nM; SGLT1: IC 50 = 1400 nM), y para canagliflozina (SGLT2: IC 50 = 4,2 nM; SGLT1: IC 50 = 660 nM) 160 veces. En este sentido, canaglifozina es el fármaco de uso clínico que exhibe menos selectividad SLGT2 frente a iSGLT1. Para la empagliflozina (SGLT2: IC 50 = 3,1 nM; SGLT1: IC 50 = 8300 nM) se ha descrito una actividad inhibidora 2700 veces mayor contra SGLT2 en comparación con SGLT1 (111, 119, 120).
- Inhibicion selectiva vs inhibición dual de cotransportadores SGLT
Las gliflozinas inhiben los symport SGLT2 en los segmentos S1 y S2 del túbulo proximal. Con ello se impide la reabsorción alrededor del 30 al 50% de la glucosa filtrada en glomérulo. Sin embargo una parte significativa de esta glucosa puede ser reabsorbida en el segmento S3 por SGLT1 (121,122,123).
SGLT1 permite que el intestino delgado absorba glucosa y contribuye a la reabsorción de glucosa filtrada por el riñón, mientras SGLT2 es responsable de la reabsorción de la mayor parte de la glucosa filtrada por el riñón. Una inhibición eficaz de SGLT2 necesita un filtrado glomerular adecuado. En los últimos años se ha extendido el uso farmacológico de los iSGLT2, que presentan unas interesantes propiedades beneficiosas "de grupo", como han demostrado numerosos ensayos con grandes ventajas sobre el área cardiovascular, gracias a efectos positivos sobre el peso, la presión arterial, los niveles de ácido úrico y el perfil lipídico. No menos importante es su efecto independiente de la acción de la insulina, lo que se manifiesta por el escaso riesgo de hipoglucemias. Además, el uso prolongado de los iSGLT2 parece favorecer la nefroprotección por reducción de la presión intraglomerular y, por tanto, del riesgo de nefropatía diabética. Por otra parte, su eficacia aumenta por la posibilidad de su uso combinado con otros fármacos orales y con insulina. (111, 124).
Sin embargo, la selectividad SGLT, en algunos de los fármacos actualmente comercializados no es absoluta, que tienen especificidades variables para uno y otro tipo de SGLT. Por ejemplo dapaglifocina, empaglifozina, canaglifocina y ertuglifozina, son principalmente iSGLT2 (como se puede apreciar en la Tabla 2), pero también exhiben, en mayor o menor medida, inhibicion SGLT1. De los cuatro citados, como se puede apreciar en la Tabla 2, la canaglifozina es la que tiene menos selectividad, aunque su inhibición SGLT2 sigue siendo superior al efecto inhibidor SGLT1 (IC 50 en mmol/l: SGLT1 de 750, frente a SGLT2 de 2,7).
Empaglifozina y tofoglifozina (esta comercializada en Japón) son las que muestran una mayor selectividad iSGLT2 (Tabla 2). La propia florizina aparece en la zona inferior de la tabla, junto a otras glifozinas (algunas aún en desarrollo) menos selectivos o con una capacidad de inhibición dual (como sotaglifozina; el O-glucosido T-1095, al que ya nos hemos referido; LX2761, potente iSGLT1 con el que se busca obviar los efectos secundarios digestivos estableciendo una pauta de dosificación ascendente; TP0438836, un ejemplo de un nuevo tipo de iSGLT1, derivado de C-phenyl d-glucitol, con escasa absorción y eliminacion biliar). Otro fármaco, muy selectivo iSGLT1, como la mizaglifozina se ha propuesto para el tratamiento del estreñimiento/constipación funcional, por su capacidad para eliminar glucosa y agua a la luz intestinal (125, 126, 127, 128))
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| Tabla 2. Comparación de la selectividad de inhibición (IC50) SGLT1 vs SGLT2 de los diferentes fármacos, tanto de uso clínico como preclínico (128). |
Se maneja la hipótesis de que la inhibición dual de SGLT1/2 podría mejorar aún más el control glucémico al dirigirse a dos órganos distintos que expresan SGLT1: el intestino y el riñón. En este sentido, los ratones con doble bloqueo (SGLT1/2) carecen por completo de reabsorción renal de glucosa. Antes hemos hablado del concepto desarrollado por Homer Smith de la "florizinación completa" (“complete phlorizination”) (38), para referirse al bloqueo completo de la reabsorción de glucosa (ya hemos señalado la falta de selectividad SGLT de la florizina, que utilizada en animales de experimentación por el grupo de Smith en los años 30 del siglo pasado conseguía la inihibición completa de la reabsorción renal de glucosa).
Inhibición intestinal SGLT1
Como hemos señalado anteriormente (Figura 38), la glucosa es absorbida por los enterocitos a través del cotransportador de sodio-glucosa 1 (SGLT1) y se difunde en el espacio basolateral a través de GLUT2, las células L también expresan tanto SGLT1 (SLC5A1) como GLUT2 (SLC2A2) (130, 131, 132).
Las células L se encuentran diseminadas a lo largo de todo el tracto intestinal, desde duodeno y yeyuno hasta colon, pero la mayor densidad de células L se encuentra en íleon y colon (XX133). La absorción de glucosa y otros monosacáridos ocurre preferentemente en yeyuno. Se maneja la hipótesis de que la inhibición SGLT1 disminuiría la absorción de glucosa en los primeros tramos del intestino, pero ello daría lugar a la llegada de una mayor cantidad de glucosa a los tramos de mayor densidad de células L. En esta situación, la respuesta de las céulas L es el aumento de la liberación de GLP1. Como consecuencia se produciría un aumento de la secreción de insulina por las células β pancreáticas, además de disminuir la secreción de glucagón por las células α pancreáticas (el glucagón estimula la neoglucogénesis hepática), retrasar el vaciamiento gástrico y disminuir el apetito (131, 132, 133).
Si se demostrara esta hipótesis, quedaría claro que un retraso en la absorción de glucosa por inhibición moderada del SGLT1 intestinal podría ser útil en el tratamiento de la diabetes y los iSGLT1 verían realzada su importancia en el tratamiento de la DM. Sin embargo, los datos son aun contradictorios en algunos sentidos y la investigación básica trata de esclarecerlos. En cualquier caso, ha quedado probado que los symport SGLT1 tienen un papel importante en la secreción de GLP1 y GIP. La evidencia procede de estudios convincentes, en ratones WT, del papel clave de SGLT1 en la secreción de GLP-1 y GIP. Estos estudios en ratones WT Sglt1-/- (ratones con delección del gen que expresa SGLT1), la administración de glucosa en intestino delgado aumenta rápidamente los niveles de GLP1 y GIP, de manera sensible a la florizina, pero no así mismo en colon. Según estos hallazgos, el sensor de glucosa para la secreción incretínica se encontraría en la región proximal de intestino delgado. La coadministración de florizina (inhibidor de SGLT1) y glucosa en el intestino superior bloqueó la absorción de glucosa y la secreción de incretinas inducida por alfa-metil-d-glucopiranósido (αMDG). Incluso la administración de αMDG sola, sin glucosa oral, mejoró la tolerancia a la glucosa y aumentó los niveles plasmáticos de incretinas (134).
La administración de glucosa a 1 g/kg (5,5 mmol/kg) en la parte superior del intestino delgado aumentó significativamente los niveles de glucosa en sangre portal. La glucosa administrada en el intestino delgado medio también aumentó los niveles de glucosa en sangre portal, asi como de GIP y GLP-1. Sin embargo, la glucosa administrada directamente en colon no aumentó los niveles de glucosa portal, GIP o GLP-1 a los 5 o 15 min después de su administración.
El ARNm de SGLT1 se detectó en gran proporción en el intestino delgado superior y medio, moderadamente en el intestino delgado inferior y apenas se detectó en el colon. El ARNm de GIP se detectó en gran medida en el intestino delgado superior y medio, pero apenas se detectó en el intestino delgado inferior y el colon. Por el contrario, el ARNm de preproglucagón, una forma precursora del ARNm de GLP-1, se detectó en gran proporción en el colon y apenas se detectó en el intestino delgado. La florizina, a 0,5 g/kg (1 mmol/kg), bloqueó completamente el aumento de los niveles de glucosa en sangre portal, GIP y GLP-1 después de la administración intraluminal de glucosa a 1 g/kg en la parte superior del intestino delgado. La administración intraluminal de los sustratos otros de SGLT, como αMDG y 3-OMG (3-O-methyl-d-glucosa) a 1,1 g/kg (5,5 mmol/kg) en la parte superior del intestino delgado también produjo aumento de los niveles portales de GIP y GLP-1; estos efectos fueron completamente bloqueados por la coadministración con florizina. Estos resultados demuestran que el sensor de glucosa para la secreción de GLP-1 inducida por glucosa se encuentra principalmente en la parte superior del intestino, de acuerdo con la distribución del ARNm de SGLT1. Sin embargo, el patrón de distribución del sensor de glucosa no se correlaciona con la distribución del ARNm del preproglucagón (el precursor del GLP-1 y otras hormonas de la familia del glucagón) y la distribución del péptido GLP-1, que había sido descrita previamente (129, 134).
Las respuestas a la glucosa y al metil-alfa-glucopiranósido se ven afectadas por el inhibidor del cotransportador de sodio-glucosa (SGLT) florizina. Se ha detectado SLGT1 y 3 en células GLUTag (*) mediante RT-PCR. Mientras que la fructosa cerró los canales de K (ATP), el metil-alfa-glucopiranósido aumentó la conductancia de la membrana y generó una corriente de entrada. Las bajas concentraciones de glucosa y metil-alfa-glucopiranósido también desencadenaron pequeñas corrientes de entrada y mejoraron la frecuencia del potencial de acción. Se concluye que, mientras las bajas concentraciones de azúcares metabolizables desencadenan la secreción de GLP-1 a través del cierre del canal de K (ATP), los sustratos de SGLT generan pequeñas corrientes de entrada como resultado de la acción electrogénica del transportador. Esta corriente asociada al transportador puede desencadenar actividad eléctrica y secreción cuando la concentración de sustrato es alta o cuando las corrientes de salida se reducen por el cierre metabólico de los canales de K (ATP). La entrada de azúcar electrogénica a través de SGLT proporciona un mecanismo novedoso para explicar la detección de glucosa por las células neuroendocrinas (135).
(*) Las células GLUTag fueron creadas por el laboratorio Drucker, constituyendo una línea celular enteroendocrina murina, relativamente diferenciada, inmortalizada y estable, que expresa el gen del proglucagón y secreta péptidos similares al glucagón de manera regulada. Esta línea celular se aisló de un tumor de células enteroendocrinas productor de glucagón que surgió en ratones transgénicos con el gen SV40 de antígeno T de glucagón. (136).
En ratones con fenotipo SGLT1-/- (que no expresan SGLT1 en mucosa intestinal y desarrollan síntomas del síndrome de malabsorción de glucosa-galactosa como en humanos) se observó una marcada reducción de los niveles plasmáticos de GIP y GLP-1 después de la exposición oral a glucosa y la glucosa no logró estimular la secreción de incretinas de cultivos intestinales in vitro. Los posibles sistemas de detección de glucosa expresados en las células enteroendocrinas L y K incluyen receptores de sabor dulce y transportadores de glucosa como SGLT1, pero sus funciones en la secreción de GLP-1 y GIP, inducida por glucosa no se han establecido completamente. Sin embargo algunos estudios han descartado prácticamente la importancia de los receptores de sabor dulce como sensores implicados en la secreción de incretinas (137).
En ratones transgénicos con expresión específica en células L de una proteína fluorescente, se han estudiado las características de las células L primarias mediante electrofisiología, imágenes de calcio por fluorescencia y análisis de expresión, y se ha mostrado que las células L individuales son eléctricamente excitables y sensibles a la glucosa. Las células L cultivadas, identificadas por su fluorescencia amarilla de la proteína Venus, exhibieron elevaciones de calcio intracelular ([Ca2+]i) en respuesta a glucosa (10 mM), α-metilglucopiranósido (αMG, 10 mM), tolbutamida (100 μM), KCl (30 mM), forskolina/IBMX (10 μM de cada uno) o bombesina (100 nM), pero no al edulcorante artificial sucralosa (1 mM o 20 mM). Las células Lneg (no marcadas con proteína fluorescente Venus) respondieron significativamente menos que las células L a la glucosa, tolbutamida, KCl y bombesina, y una proporción de las células Lneg, pero no las células Lpos, respondió a la sucralosa. Los efectos significativamente mayores de la glucosa y la tolbutamida en las células Lpos que las células
Lneg sugieren que la respuesta a la glucosa se origina en las propias células L. Al marcar con fluorescencia las células que expresan proglucagón en un ratón transgénico, se demostró que las células L primarias son eléctricamente excitables y directamente sensibles a los nutrientes.
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| Figura 38. La glucosa de la dieta es detectada por SGLT1 en las células L del intestino delgado proximal, lo que posteriormente conduce a la liberación aguda del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1). La inhibición de SGLT1 tiene múltiples efectos: (i) inhibición de la absorción de glucosa y (ii) liberación aguda y sostenida de GLP-1 (128). |
La inhibición intestinal de SGLT1 afecta a la homeostasis de la glucosa. Inhibe directamente el transporte de glucosa a través de las células intestinales del borde en cepillo; pero, por otra parte, de forma indirecta, la mayor concentración de glucosa en regiones distales intestinales (ileon y colon), estimula los receptores SGLT1, que en este caso actuan como sensores en las células L y probablemente tambien en células K, induciendo un aumento prolongado de GLP-1 y posiblemente la liberación de GIP (Figura 38). La inhibición de SGLT1 ofrece la posibilidad de potenciar los efectos de los inhibidores de SGLT2 o puede tener sus propias indicaciones separadas para el tratamiento de otras enfermedades, por ejemplo, estreñimiento, obesidad o síndrome de ovario poliquístico (128).
Inhibición renal SGLT1
El symport SGLT1 renal contribuye aproximadamente al 3% de la reabsorción fraccionada de glucosa en condiciones de normoglucemia. Sin embargo, en condiciones de hiperglucemia o durante la inhibición de SGLT2, esta contribución puede aumentar sustancialmente (hasta 40 a 50%) cuando llega más glucosa al tramo distal del túbulo proximal. Los symport SGLT1 renales ejercen, por tanto, un efecto compensador, tanto en el caso de hiperglucemia (en dicha situación se puede sobrepasar el dintel renal de glucosa y los mecanismos de reabsorción aumentan fisiológicamente su eficacia), como cuando se produce un bloqueo farmacológico de SGLT2 a nivel proximal del túbulo contorneado proximal. La inhibición genética, en ratones knockout, que no expresan SGLT2, permitió estimar que la capacidad de reabsorción de glucosa general basal para SGLT2 frente a SGLT1 en un riñón de ratón no diabético está en el rango de 3:1–5:1. El aumento dependiente de la carga en la reabsorción de glucosa mediada por SGLT1 explica por qué los inhibidores de SGLT2 en condiciones normoglucémicas mejoran la excreción urinaria de glucosa a sólo ~ 50% de la glucosa filtrada. El papel de SGLT1 en la reabsorción de glucosa tanto renal como intestinal proporciona un fundamento para el desarrollo de inhibidores duales de SGLT1/2 (139).
A pesar de que el SGLT2 normalmente contribuye a del 90% de la reabsorción fraccionada de glucosa, la inhibición farmacológica o genética de SGLT2 en pacientes y ratones mostró que la FGR sólo se reduce a aproximadamente el 40-50%. Ésta es la consecuencia de un papel compensador de SGLT1 en el túbulo proximal tardío (128).
Estos hechos, junto con los hallazgos ya mencionados anteriormente de que los inhibidores de SGLT2 altamente selectivos pueden disminuir la reabsorción tubular de glucosa solo hasta en un 50% debido al aumento de la reabsorción de glucosa por SGLT1 en el segmento S3, hoy en día intensifican la búsqueda de inhibidores duales de SGLT1 / SGLT2. Compuestos como la sotagliflozina (anteriormente LX-4211) (Tabla 2) se aplican también junto con la insulina en la terapia de la diabetes tipo 1 (140).
Como resumen, podríamos decir que los dos principales cotransportadores de sodio-glucosa, SGLT1 y SGLT2, proporcionan nuevos objetivos terapéuticos para reducir la hiperglucemia en pacientes con diabetes. SGLT1 permite que el intestino delgado absorba glucosa y contribuye a la reabsorción de glucosa filtrada por el riñón. SGLT2 es responsable de la reabsorción de la mayor parte de la glucosa filtrada por el riñón. Los inhibidores con especificidades variables para estos transportadores (p. Ej., Dapagliflozina, canagliflozina y empagliflozina) pueden reducir la velocidad de absorción intestinal de glucosa y aumentar la eliminación renal de glucosa en la orina. Los resultados de los ensayos clínicos aleatorizados han demostrado la eficacia hipoglucemiante de los inhibidores de SGLT en la diabetes tipo 2 cuando se administran como monoterapia o además de otras terapias hipoglucemiantes, incluida la insulina. El aumento de la eliminación renal de glucosa también ayuda a perder peso y podría ayudar a reducir la presión arterial. La inhibición eficaz de SGLT2 necesita una filtración glomerular adecuada y podría aumentar el riesgo de infección del tracto urinario y genital, y la inhibición excesiva de SGLT1 puede causar síntomas gastrointestinales. Sin embargo, el mecanismo de acción independiente de la insulina de los inhibidores de SGLT parece ofrecer una eficacia hipoglucemiante duradera con un riesgo bajo de hipoglucemia clínicamente significativa en cualquier etapa de la historia natural de la DM2(141).
Además, la captación de glucosa a través de SGLT1 por las células K y las células L intestinales contribuye a la secreción de GIP y del GLP1, respectivamente, y regula al alza la producción de GLUT2 (137).
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